基因打靶备乳腺生物反应器研究进展

基因打靶技术是建立在胚胎干细胞和同源重组技术之上,可对基因组进行定点修饰的实验方法。用基因打靶技术制备乳腺生物反应器,克服了显微注射法的众多缺陷。本文简述了制备乳腺生物反应器过程中基因打靶的策略、靶细胞、打靶位点及国内外研究进展和展望等。     

浅谈猪瘟免疫失败的原因

猪瘟是由猪瘟病毒(HCV)引起的一种高度接触性传染病。猪瘟具有高度接触传染性,流行广泛,发病率、死亡率高,是危害我国养猪业最重要的传染病之一。我国自1954年成功研制出猪瘟兔化弱毒疫苗以来,有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行。但是,近些年来,转变为周期性、波浪式的     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

禽流感病毒HA基因的分子克隆和测序

血凝素（HA）是禽流感病毒诱导机体产生保护性体液免疫反应的主要靶抗原。本研究的目的是克隆HA基因，为以后的表达及基因工程疫苗的研制奠定基础。收获接毒鸡胚的尿囊液，超速离心沉淀病毒，采用异硫氰酸胍法提取病毒RNA，利用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）技术扩增出禽流感病毒（H9N2亚型）血凝素的cDNA。PCR产物加A尾后，用玻璃奶试剂盒回收纯化目的片段，通过T－A连接将加尾PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-T easy vector，转化DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切鉴定，对目的片段进行测序，结果获得了HA基因全长，约1．7kb，与已知序列进行同源性比较，同源性最高的可达97％，所克隆的基因为禽流感HA基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

The Extent and Control of Avian Influenza in Canada

The large variety of influenza A virus types circulating among wild birds in their northern breeding grounds represents a menace to the Canadian poultry industry. The principal victims of avian influenza in the past were turkeys, exceptionally affected were ducks, but never chickens. Influenza in Ontario turkeys reached a peak incidence at the end of the 60's, then it declined steadily to isolated infrequent infections. The decline is attributed to efforts made to avoid contact between domestic turkeys and wild birds. The prospect of controlling avian influenza by vaccination is discounted, and it is recommended to place more emphasis on isolation of the turkeys and improved sanitation on the farms.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒（AIV）A／Goose／HLJ／p46／2003（H5N1）的NSl基因，将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上，转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析，表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示，重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后，经0．3mmol／L的IPTG诱导，融合蛋白MBP-NS1得到大量表达，融合蛋白以可溶形式存在，分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明，融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应，而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法，为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。     

荧光实时定量PCR方法检测猪链球菌2型

以猪链球菌2型的荚膜多糖抗原编码基因cps2J为靶基因设计引物,利用SYBR GreenⅠ能特异地与双链DNA结合发出荧光的特性,以ABI7000为平台,建立荧光实时定量PCR检测猪链球菌2型的方法。该方法检测猪链球菌2型参考株和猪链球菌2型国内分离株都呈阳性,具有良好的特异性。整个检测过程于2h内完成,检测限度为24CFU,标准曲线的相关系数为0.997。对5份采集于猪链球菌2型病猪的病料进行检测,结果表明肝脏和脾脏最适于检测。     

牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用

根据已发表的牛分枝杆菌的pncA的基因序列，设计和合成了一对可扩增294bp目的片段的引物，建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法。对牛分枝杆菌国际参考株和国内分离株成功扩增出294bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌和草分枝杆菌DNA的PCR扩增结果均为阴性。本PCR方法检测的敏感度可达到50pg。对10份牛分枝杆菌培养阳性和10份阴性样品的DNA分别进行了PCR检测，结果10份阳性样品中有9份样品为PCR扩增阳性，阳性符合率为90％（9／10）；而10份阴性样品则PCR扩增全部为阴性，阴性符合率为100％（10／10）。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

基于Maize6H-60K芯片精准分型的玉米DH群体遗传规律研究

为解析玉米双单倍体（doubled haploid,DH）群体的遗传规律,使用自主研发的精准分型策略对‘先玉335’DH群体的Maize6H-60K芯片结果进行筛选校正和解析。结果表明：1）通过剔除单态、杂合、缺失标记,使用精准分型策略对标记准确聚类,获得的18 947个SNPs标记覆盖玉米全基因组。2）该群体在10条染色体上平均交换次数为1.84～1.03次,在6号染色体随体区域的交换次数显著减少。3）该群体在1、2、3、8号染色体上存在明显的偏分离现象;通过高频次、高密度的交换,染色体两臂端粒区域理论分离系数表现出回归到50%的趋势。利用获得的重组交换及分离规律可提高从DH群体中筛选到预期育种材料的准确性。     

稳健统计技术在实验室间能力验证中的应用

文章对稳健统计技术在实验室间能力验证中的统计分析设计、数据处理、稳健Z比分数计算、能力评价和能力验证计划结果的报告做了阐述,为能力验证实施机构进行能力验证计划的设计、数据统计处理和实验室能力评价提供参考。