人CD14信号肽介导卵清蛋白在HEK293T细胞的高效表达

本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白（ovalbumin,OVA）基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5’端与人CD14信号肽序列融合和非融合的OVA基因,并将它们分别插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成表达载体pcDNA-CD14sp-OVA和pcDNA-OVA。经磷酸钙介导,将质粒转染至HEK293T细胞,使其进行表达,用鼠抗OVA单克隆抗体通过免疫印迹（Western blot）法检测OVA表达水平。结果表明:本试验扩增的OVA基因序列与GenBank中的序列（登录号NM₂05152）一致,构建的人CD14信号肽序列融合OVA基因的表达载体结构正确。经过在HEK293T细胞的表达,融合人CD14信号肽序列的重组蛋白OVA的表达水平明显得到提高。结果提示,融合人CD14信号肽序列后的重组蛋白OVA在非输卵管上皮细胞中的表达水平明显提高,为OVA基因作为DNA疫苗模式抗原的应用提供了必要的条件。     

鸭出血症血凝及血凝抑制试验的建立和应用

鸭出血症是由不同于鸭瘟病毒的鸭新型疱疹病毒引起的鸭的一种传染性疾病。根据该病毒可凝集Balh／c小鼠红细胞的特性，我们建立了鸭出血症血凝及血凝抑制试验，经试验表明该方法是一种快速、实用、特异性强的检测方法。     

应用FA及PPA-ELISA技术对猪瘟的检测

用免疫荧光抗体诊断技术及单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验诊断技术对疑为猪瘟病毒感染猪进行了检测 ,重点阐述了 2种方法的技术原理和操作过程。通过用免疫荧光抗体诊断技术检测了 5份病料 ,其中有 2份为阳性 ,阳性率为 40 % ;用单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验诊断技术检测了猪瘟血清抗体 ,在 40头母猪血清样品中 ,猪瘟弱毒抗体效价 OD值较高 ,有 1 0 0 %的保护率 ,但是发现母猪群中有 1 0 %隐性猪瘟感染 ,其强毒抗体效价 OD值大于 0 .5,体内带有猪瘟病毒。结果及过程表明此两种诊断方法检测快速、鉴别准确、分辨率高     

PRRSV GP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。     

基因芯片技术在钩端螺旋体病传染源监测中的应用

为了将合成的核酸探针点样到玻片 上制备成基因芯片,先用常规PCR扩增动物 组织中钩端螺旋体特异片段,再用Cy3标记 引物,通过不对称PCR获取荧光素标记的靶 序列,然后与制备的芯片杂交,扫描仪记录结 果。同时,以PCR技术为对照,进一步观察 基因芯片技术检测动物传染源中钩端螺旋体 的特异性、敏感性及可行性。常规PCR扩增 问号钩端螺旋体阳性标本,出现单一482bp 的扩增产物,而双曲钩端螺旋体及其他螺旋 体、病原、正常动物组织均无任何DNA扩增 条带,芯片杂交结果与常规PCR方法结果一 致。用芯片和PCR对动物组织中不同浓度 钩端螺旋体的检测,最低检测浓度分别为10 条和100条钩端螺旋体,芯片检测的敏感性 高于常规PCR法。用基因芯片与PCR分别 对标本进行检测,5只人工感染的豚鼠肾、 肝、心、血等组织的检测结果均为阳性;28份 疫区野鼠肾标本阳性结果分别为8份和4 份,10份可疑病猪肾标本阳性结果分别7份 和5份;5份非疫区野鼠肾、5份正常猪肾标 本以及其他微生物的检测结果均为阴性。结 果表明,基因芯片技术可快速、灵敏、特异地 检测动物传染源中问号钩端螺旋体。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从安徽省巢湖地区鸡群中出现的以肾肿大为主要特征的呼吸道疾病的病例中分离到1株病毒,易感雏鸡,病死鸡出现肾肿大、苍白呈花斑状、大量尿酸盐沉积;鸡胚连续盲传至第5代时开始出现死亡和侏儒胚.电镜观察可见80～120nm的病毒颗粒.分离病毒在鸡胚上可干扰新城疫病毒clone-30株的增殖.上述试验证实所分离的病毒为鸡肾型传染性支气管炎病毒,暂定名为NIBV-AH99.     

兽药缓控速释药剂型的研究进展

简要介绍了兽药缓控速释剂型的产生、发展、动力学过程及其分类,并着重阐述了兽药缓控速释药的应用现状、发展动力、研究热点与趋势,分析了兽药缓控速释剂型研究中存在的问题,旨在为广大兽医药工作者研制兽药新剂型提供参考。     

犬瘟热病毒DNA疫苗接种犬的免疫保护

用犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白基因(H、F)和核蛋白基因(N)重组质粒DNA和聚乙烯胺(PEI)混合后肌注10只3月龄CDV抗体阴性毕格犬,间隔30 d,共免疫3次,另选择5只犬作为阴性对照.免疫3次后,采用CDV攻毒.对照组呈现出犬瘟热的典型症状和组织病理损害,攻毒3周内,有2只犬衰竭死亡,1只犬症状明显,攻毒第18天外周血淋巴细胞中病毒RNA检测为阳性.DNA疫苗免疫组除出现一过性的体温升高外,未出现明显症状,攻毒后第18天外周血淋巴细胞CDV检测仍为阴性.DNA疫苗免疫后血清ELlSA抗体和病毒中和抗体测定显示,首免后机体激发的ELISA抗体滴度很低(101.25±0.615),二免后开始缓慢升高(101.69±0.285),再次免疫后达到102.051±0.214;中和抗体也呈现以上规律,三免后血清中和抗体为101.75±0.190,攻毒后血清ELISA抗体和中和抗体滴度迅速升高(103.02±0.202和102.41±0.245).试验表明CDV基因免疫对CDV的感染具有较好的保护作用,并能清除进入机体内的病毒.CDV基因免疫只激发较低水平的体液免疫,中和抗体在攻毒前达不到临界保护线(102),但对CDV攻击能产生较好的保护,推测其免疫效力可能源于细胞免疫和记忆性B淋巴细胞.     

湖南省部分地区商品鸡异刺线虫感染情况调查

为了了解湖南省商品鸡异刺线虫感染情况,2007年2月～9月,笔者应用寄生虫学完全剖检法,对湖南省长沙、湘潭、永州、常德和娄底五个地区的275羽商品鸡,进行了鸡异刺线虫的感染情况调查。结果显示,商品鸡总体感染率为42．2％（116／275）,平均感染强度为10．4。丘陵区鸡异刺线虫的感染率最高,感染率介于70％-100％之间;湖区和市区的感染率依次居后,分别只有36．4％和32．3％。     

柔嫩艾美耳球虫G6-PI基因的克隆、序列分析与原核表达

为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,G6-PI)的生化特性,本研究对其基因进行了克隆和原核表达。根据NCBI已公布的E.tenella Houghton株G6-PI的基因序列(GI:298161921)设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtG6-PI基因序列,并将其克隆到表达载体pColdI、pCold43a中,构建重组质粒pColdIEtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞E.coli Rosetta(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,E.tenella G6-PI的ORF序列(1650 bp),编码550个氨基酸;重组菌pColdI-EtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI均能成功诱导表达,其中pCold43a-EtG6-PI表达部分可溶性蛋白,表达产物纯化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球虫G6-PI基因的成功克隆表达为该酶的功能研究奠定了基础。