3种甜樱桃病毒PNRSV、PDV及LChV-2的多重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）、李矮缩病毒（Prune dwarf virus,PDV）、樱桃小果病毒2（Little cherry virus-2,LChV-2）的多重RT-PCR检测方法。【方法】以复合感染3种病毒的甜樱桃病株叶片为材料,采用CTAB法提取样本总RNA,选用随机六聚体引物对植物样本总RNA进行反转录,所得cDNA作为多重RT-PCR的扩增模板。根据GenBank中PNRSV、PDV、LChV-2基因组序列共设计6对特异引物,分别通过单一RT-PCR和多重RT-PCR筛选出可用于同时检测3种甜樱桃病毒的引物组合。对多重RT-PCR的退火温度及循环数进行优化,以筛选出各引物组合的最适扩增条件。分别以单一感染PNRSV、PDV、LChV-2、复合感染3种病毒、单一感染樱桃病毒A（Cherry virus A,CVA）及甜樱桃无毒苗为样本,对多重RT-PCR引物的特异性进行分析。选取复合感染3种病毒的甜樱桃总RNA的反转录产物为初始模板,按照梯度稀释法依次将模板稀释为2、22、23、24、25倍,在相同PCR反应体系及反应条件下分别对各引物组合的灵敏度进行分析。多重RT-PCR的扩增条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接至pMD18-T vector,克隆测序,以验证多重RT-PCR检测的准确性。并应用该方法对山东泰安地区甜樱桃生产园中间隔栽培的中国樱桃进行检测。【结果】筛选到2个可以应用的引物组合,组合1“PNRSV-S1/A1、PDV-S2/A2、LChV2-S1/A1”可分别特异性地扩增733、467、337 bp的片段。组合2“PNRSV-S1/A1、PDV-S3/A3、LChV2-S1/A1”可分别扩增得到733、265、337 bp的片段。扩增产物大小与预期相符。多重RT-PCR反应条件优化结果显示,在退火温度52℃、35个循环条件下,2个引物组合的检测效果均较为理想。特异性分析结果显示,2个引物组合均能特异性检测其各自的靶病毒。灵敏度分析结果显示,2个引物组合在cDNA的23×稀释液中仍能特异性扩增,但扩增条带的强度稍有差异,其对植物总RNA的反转录产物的最低检测浓度为107.9 ng•μL-1。克隆测序及序列分析表明,2个引物组合对各自靶病毒的检测结果可靠。应用该方法对9个中国樱桃样本进行检测,结果显示,测试样品均至少感染了2种病毒,其中5个样品复合感染了3种病毒,2个样品同时感染PDV和LChV-2,2个样品同时感染PNRSV和LChV-2。【结论】应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏的同时检测单一或复合侵染的3种甜樱桃病毒。     

核桃JrCOR基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从核桃品种‘香玲’叶片中克隆了一个脱水素基因JrCOR,其全长1 156 bp,具有741 bp的开放阅读框,编码由246个氨基酸组成的多肽,具有LEA家族成员的特征多肽序列。以核桃18S rDNA为内参基因,对核桃品种‘香玲’JrCOR基因在4℃胁迫下的表达模式进行初步研究,结果表明低温诱导下叶片中JrCOR基因的表达增加,4℃处理4 h时达到最大值;自然越冬条件下,花芽中JrCOR表达量呈先上升后下降的趋势,在12月份表达量最高,推测JrCOR基因在核桃对低温胁迫响应中发挥重要功能。     

甜樱桃砧木PcDHN1的克隆及其对非生物胁迫的响应

为明确甜樱桃砧木脱水素基因特征及其在干旱、高盐和低温胁迫过程中的表达模式,以甜樱桃砧木Y1为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了甜樱桃砧木脱水素基因Pc DHN1,利用生物信息学分析其编码蛋白特征,并采用qRT-PCR分析该基因的表达模式。序列分析显示,甜樱桃砧木脱水素基因Pc DHN1的c DNA全长893 bp,编码225个氨基酸,推测编码蛋白分子量约为23.98 k D,理论等电点为8.65。氨基酸序列分析显示,Pc DHN1含有2个Y-片段、1个S-片段和2个K-片段,具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于YnSK2型脱水素。表达特性分析显示,Pc DHN1在干旱、高盐和低温胁迫条件下受胁迫诱导而上调表达,但对低温胁迫响应比较迟缓,说明该基因可能参与了甜樱桃砧木对干旱和高盐胁迫的耐受调节过程。本研究结果为甜樱桃砧木抗逆基因工程提供了一定的参考。     

甜樱桃流胶病原菌的分子鉴定和致病性检测

 为明确甜樱桃流胶病的病原菌,采用普通细菌学方法从15个病样中分离获得10个代表性菌株,对病原菌的形态学特征、生理生化特性以及致病性进行了研究。利用PCR对菌株的16S-23S rDNA转录间隔区(ITS)序列进行扩增,扩增产物克隆测序,结果显示该菌株属于丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。用MegAlign构建系统发育树,结果显示该菌株与丁香假单胞菌丁香致病变种(P. syringae pv. syringae)亲缘关系最近,两者最先聚在一起。分离菌株中均可检测到syrB基因。研究结果表明P. syringae pv. syringae为甜樱桃流胶病的病原菌。     

干旱胁迫对甜樱桃吉塞拉砧木光合的影响

以甜樱桃吉塞拉系列砧木-吉塞拉6号(G6)、吉塞拉5号(G5)、Y1和B5的1 a生盆栽实生苗为试材,检测了其在干旱处理下的光合和叶绿素荧光参数。结果表明:干旱胁迫影响了吉塞拉砧木的叶绿素含量、光合参数和叶绿素荧光参数,各试材的净光合速率(Pn)、PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)、实际原初光能转化效率(ΦPSⅡ)和表观电子传递速率(ETR)随胁迫程度的加重显著下降。干旱胁迫对吉塞拉砧木光合影响的效应既有品种间差异,又有处理间差异,轻度干旱促进了G5和B5的光合,而重度干旱胁迫对4种吉塞拉砧木的光合均产生抑制作用。     

苹果基因邻近未知序列的PCR扩增方法

利用已知基因序列设计3个巢式PCR引物p14、p15和p16,然后设计3'端为常见酶切位点、5'端为随机引物序列p17的9个酶切位点引物.用p14外引物与9个酶切位点引物进行第1轮PCR扩增,其中前5个反应采用较低的退火温度,目的是将酶切位点引物的5'端序列引入到PCR产物中,其余反应则以此PCR产物为模板采用较高的正常退火温度进行,目的是为了使整个酶切位点引物能稳定地结合到最初反应形成的产物上.为提高PCR产物的特异性和产量,用p15和p16引物分别与p17引物配对进行第2轮和第3轮PCR扩增,电泳检查发现PCR产物条带后进行纯化和测序.为保证序列的正确性,利用测得的DNA序列再设计新引物f3x,将f3x与p14(或p15)配对、直接用提取的DNA为模板进行PCR扩增和测序.利用此方法成功地获得了苹果FPPS基因邻近的启动子序列528bp和5'UTR序列142bp,并已在GenBank注册(登录号FJ263960),利用Blastn发现这是GenBank中首次发表苹果(Malus domestica Borkh.)法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)启动子序列.     

甜樱桃砧木PcWRKY71基因克隆及表达分析

为研究甜樱桃砧木WRKY71转录因子的功能及其对非生物胁迫和激素处理的响应,本研究克隆了甜樱桃砧木‘Gisela 6’的PcWRKY71基因序列,序列分析表明PcWRKY71完整开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸,含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂锌指结构域,属于WRKY基因家族第Ⅱ类成员。生物信息学分析推测PcWRKY71编码蛋白分子量为37.41 kDa,理论等电点为6.72,属于不稳定的亲水性蛋白,定位于细胞核上,与甜樱桃和樱花的亲缘关系最近。荧光定量分析结果表明,PcWRKY71基因表达受干旱、盐害和低温胁迫诱导及激素SA和MeJA影响,说明PcWRKY71转录因子对甜樱桃砧木应答非生物胁迫和激素处理起着重要作用。     

SYBR Green I实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用

为了探讨SYBRGreenI实时定量RT—PCR技术在甜樱桃病毒粒子定量分析中的应用前景,以复合感染李属坏死环斑病毒（Prunusnecrotic ringspot virus,PNRSV）、李矮缩病毒（Prune Dwarf vi—rus,PDV）、樱桃病毒A（CherryvirusA,CVA）、樱桃小果病毒一2（Little cherry virus一2,LChV－2）的甜樱桃“红灯”PrunusaviumCV．RedLamp植株为研究对象,采用相对定量方法,分析各病毒的外壳蛋白基因的表达,用以指示病毒的增殖量。在花、幼叶、功能叶、衰老叶中均能检测到4个基因,但各基因表达量在各器官中存在差异。PNRSV-CP与CVA—CP表达模式相似,功能叶中明显高于其它器官,衰老叶中急剧降低。PDV-CP与LChV2一卯表达模式类似,幼叶中的表达量较高,功能叶片中较低。PNRSV-CP在花、功能叶中的表达显著高于其它3个病毒基因。LChV2一cP在各器官中的表达量均低于其余3个基因。该方法适用于植物组织内多种甜樱桃病毒增殖量的分析。     

矮砧甜樱桃小冠疏层形整形修剪技术

采用小冠疏层形可使矮砧甜樱桃树体骨架牢固,有效地延长树体寿命.该树形干高40～60cm,树高3.0～3.5m,树冠直径4m左右;主枝分3层,第1层主枝上培养2～3个侧枝,第2层主枝上培养1～2个侧枝,第1～2层间距60cm左右,第3层主枝上直接着生结果枝组.     

山东省蓝莓生产科研现状及发展前景

介绍山东省蓝莓的生产科研现状,适宜蓝莓发展的区域,栽培面积、栽培品种和栽培技术.分析山东蓝莓生产发展前景.