猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北美型毒株和欧洲型毒株N蛋白基因保守序列,设计1对特异性引物和1条探针,以ABI公司PRRSV RNA为标准品,优化了PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测方法,25μL反应体系引物prrsv-f/prrsv-r（20μmol/L）各0.5μL,探针prrsv-p（10μmol/L）0.5μL为反应最佳工作浓度,标准曲线Ct值和模板启始浓度的log值之间具有良好的线性相关性。特异性、敏感性和重复性检测结果显示,该方法能特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株,与其他主要猪病病原检测无交叉反应;针对PRRSV RNA标准品检测,灵敏度可以达到10拷贝;重复性检测Ct值变异系数为0.74%～1.52%。用建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法,对40份临床样品检测,与商品化试剂盒检测结果完全一致。     

山羊源无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)的分离鉴定与耐药性分析

为了对1起羊腹泻病例进行诊断,从腹泻病羊粪便中分离到10株革兰阳性棒状杆菌YN21083～YN210812,对分离株进行形态学和16S rDNA基因鉴定并研究其药物敏感性和耐药基因特征。NCBI数据库BLAST比对鉴定结果显示,10株分离株与无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)德国分离株FDAARGOS＿991的同源性为99.3%～100.0%。16S rDNA基因进化分析显示10株分离株与C.amycolatum参考株形成同一个进化分支,与C.amycolatum参考株之间的同源性为97.2%～100.0%,与C.amycolatum模式菌株ATCC49368^T之间的同源性为98.3%～99.2%,将10株分离株鉴定为C.amycolatum。药敏试验结果显示,10株分离菌株对青霉素、氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻吩、头孢呋辛、氟苯尼考、阿米卡星和四环素敏感,对卡那霉素和磺胺甲恶唑耐药。耐药基因PCR检测结果显示,共检测到8种耐药基因aadA1、aadA2、tetA、tetM、qnrS、Sul1、Sul2和Sul3,其检出...     

阿卡斑病毒培养特性和灭活疫苗免疫效果评估

为制备一种阿卡斑病毒灭活疫苗并初步评价其免疫效果,本研究应用组织半数感染量(TCID₅₀)测定的方法对阿卡斑病毒CX-01株在HmLu-1、Vero、BHK-21细胞上的扩繁规律进行判定,研究病毒在终浓度0.002 mol/L的BEI灭活剂、37℃条件下的灭活规律,然后应用ISA 206佐剂乳化制备疫苗,通过小鼠模型评估抗原中的添加剂蔗糖、海藻糖和左旋咪唑对免疫效果的影响。结果：HmLu-1细胞培养病毒效价最高为10^6.75 TCID₅₀/mL,优于Vero和BHK-21细胞;终浓度为0.002 mol/L的BEI灭活剂处理5 h即可完全灭活病毒,为确保对阿卡斑病毒的灭活完全彻底,在BEI灭活剂用量和灭活条件不变的前提下,选择最优的灭活时间为8 h;添加5%蔗糖、5%海藻糖、1%左旋咪唑的疫苗组免疫效果最好,平均中和抗体滴度为18.0。本研究结果对阿卡斑病毒的培养和灭活疫苗的制备具有一定的借鉴意义。     

云南流行山羊痘病毒的PCR鉴定及基因序列分析

2003年,在云南省的多个地州暴发了山羊痘.我们根据国外山羊痘病毒基因序列,设计1对聚合酶链反应(PCR)引物,用于扩增羊痘病毒的SVF基因,建立PCR诊断方法.     

曼氏杆菌(Mannheimia pernigra)的分离鉴定及基因组序列分析

为了对云南3起奶牛和山羊呼吸道疾病进行病原检测,本研究在5%CO2的培养条件下从呼吸道疾病奶牛和山羊的肺脏中分离到3株革兰阴性嗜二氧化碳小杆菌YN21118、YN22011和ZY171111,对3株分离株进行16S r DNA基因的PCR扩增及同源性和遗传进化分析,结果显示3株分离株与曼氏杆菌(Mannheimia pernigra)模式菌株CCUG 74657T及其它M. pernigra分离株的16S r DNA基因序列的同源性达99.6%以上,且3株分离株与M. pernigra参考株形成同一个进化分支,表明3株分离株均为M. pernigra。采用琼脂扩散法检测3株分离株对10类32种抗菌药物的敏感性,结果显示3株分离株对青霉素类的阿莫西林克拉维酸、头孢菌素类的头孢噻吩、喹诺酮类的氧氟沙星等29种抗菌药物敏感。将3株分离株感染小鼠进行致病性试验,结果显示3株分离株均能引起小鼠呼吸道疾病。采用Illumina Miseq和PacBio高通量测序平台对分离株ZY171111进行全基因组高通量测序并预测其毒力基因和耐药基因,基因组序列分析结果显示,分离株ZY171111基因组全长2 ...     

猪瘟病毒Erns基因的克隆及原核表达

从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,通过R-PCR对Erns基因进行cDNA扩增,获得了696 bp的片段.将该片段克隆于T-easy载体后进行序列分析,确认PCR产物为猪瘟病毒Erns基因,从阳性克隆中提取质粒,经Bam H Ⅰ和Hin d Ⅲ双酶切,回收产物亚克隆到pET-32a表达载体中,提取质粒后转化BL21(DE3)感受态细胞,并筛选出阳性克隆,经IPTG诱导后通过SDS-PAGE检测出Erns基因的表达.     

云南山羊产业草畜均衡问题探析

突破以草载畜的传统思维模式,以国家农业部山羊饲养标准为依据,估算云南省现实山羊存栏的理论饲草料需要量,结合实际调研情况,提出实现云南山羊产业草畜均衡供给的对策和建议。     

大肠杆菌多价抗体(猪泻停)口服防治仔猪腹泻效果观察

仔猪腹泻是重要的幼畜疾病 ,对养猪业危害很大。由于仔猪免疫器官发育不健全 ,一旦发生 ,发病率及死亡率高 ,是造成仔猪成活率低的主要原因〔1,2〕。仔猪腹泻是以下痢为主要症状的疾病 ,耐过猪生长发育不良 ,成为所谓的“僵猪” ,是当今世界各国养猪业中提高经济效益的重大问题之一。仔猪腹泻发病原因复杂 ,病原多种多样 ,包括细菌、病毒、螺旋体、原虫、真菌及其毒素〔3〕。其中主要的病原为致病性大肠杆菌 ,也是仔猪腹泻最常见的病原菌之一 ,可引起初生仔猪黄、白痢 ,断乳后综合征和水肿病〔5〕。根据世界各国研究结果 ,确定了最常见的仔…     

犬瘟热病毒F基因克隆及序列分析

从犬瘟热病毒检测阳性的3份(KM1、KM2、KM3)病料中进行F基因的克隆测序,并与其他5株代表性参考毒株的同一基因序列进行比较(国内外流行毒株以及疫苗毒株).结果表明,KM1与KM2有95.7%的核苷酸同源性,其氨基酸序列完全相同;KM3株与KM1有1个氨基酸的差异,与参考的5株犬瘟热病毒的F基因核苷酸和氨基酸分析同源性分别为91.1%～96.5%和96.8%～100%.     

云南山羊感染嗜吞噬细胞无浆体调查分析

为了解云南山羊无浆体的感染及发病情况,2018—2019年从云南12个县20个山羊养殖场/户采集全血样品983份,进行原虫病原学调查及遗传进化分析。调查结果表明:云南山羊存在无浆体感染,但其感染率维持在较低水平,仅有石林县1个养殖场的3份样品为嗜细胞无浆体阳性,总血液样品阳性率为0.3%;通过16S rDNA测序比对验证,阳性感染场3份无浆体均为嗜细胞无浆体(登录号:MN922957),基于16S rDNA基因序列构建的遗传进化树表明,云南感染株SHILIN与嗜吞噬细胞无浆体新疆绵羊株KG782376核苷酸同源率为100%,与陕西株MG869254同源率为99.7%,与边缘无浆体同源率为96.9%。