猪瘟病毒基因型概述

猪瘟的发生和流行严重危害我国及世界养猪业的健康发展。由于猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)只有一个血清型,所以基于传统的血清学方法针对临床上CSFV开展流行病学研究较为困难。随着分子生物学的发展,人们在对CSFV基因结构进行研究的过程中发现,基于其部分基因序列可以将该病毒分为若干基因型和基因亚型,进而揭示CSFV的区域分布和进化规律,有效地追踪CSFV的起源和传播特点。论文结合我国已有的CSFV流行病学数据,对现有的CSFV基因分型标准进行介绍,为进一步研究CSFV的变化规律、监测新型病毒出现,以及制定有效的防控净化措施提供参考。     

地高辛标记DNA探针检测伪狂犬病的研究

利用伪狂犬病病毒特异性扩增产物制成地高辛标记的探针，对闽Ａ株，鄂Ａ株，Ｂａｒｔｎａ株，英国株及临床病料进行检测，其结果与ＰＣＲ检测结果相符，准确率为１００％，灵敏度达到２ｐｇＤＮＡ，试验认为该探针具有灵敏、特异、安全的特点     

牛支原体、巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌多重PCR快速检测方法的建立

本试验旨在建立一种可同时鉴别牛支原体、巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌的多重PCR方法。分别针对多杀性巴氏杆菌A型特异的hyac-hvaD基因区段、化脓隐秘杆菌的16SrRNA基因上保守区段和牛支原体的UvrC基因设计特异性引物,多重PCR的最佳扩增条件确定为：95℃ 10min预变性;95℃ 1min,56℃ 50s,72℃ 1min,循环30次;72℃ 210min延伸。结果表明,该多重PCR方法可同时扩增出以上三种致病菌的特异性片段,不能扩增出其他病原菌的相关片段;对多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和牛支原体的最低检测浓度分别为8×10^5CFU／mL、8×10^5CFU／mL和4×10^6CFU／mL。同时用该方法检测了牛支原体肺炎患牛的鼻拭子与肺组织,发现12h预增菌后,肺组织检测与牛支原体培养的阳性符合率为92％。对临床样本进行牛支原体分离培养需要3-4d时间,而采用多重PCR方法检测12h预增菌则能在24h内出结果。该多重PCR方法显著加快了临床诊断速度,具有推广应用价值。     

猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体的制备及鉴定

[目的] 纯化猪塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV）SVV-CH-HB2016毒株，并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体。[方法] 以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行细胞融合。通过间接免疫荧光试验（IFA）结合间接ELISA筛选阳性细胞株，制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株。采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性，并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定。利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响，最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位。[结果] 在蔗糖密度梯度为5%~45%（W/V）时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白，免疫小鼠血清抗体效价均达到了1：12 800，成功制备了17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western blotting反应，17株单克隆抗体能与病毒发生IFA作用；2G6、4A3和4C11 3株单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株感染的BHK-21细胞具有明显中和保护作用，也能有效抑制SVV-CH-HB2016毒株对293T细胞的吸附。经分析发现，除1F5与2E1、4B8与4F11外，其余10株单克隆抗体分别针对不同抗原表位。[结论] 本研究初步建立了SVV的纯化方法，制备了17株特异性针对SVV-CH-HB2016毒株的单克隆抗体，为后期进一步开展SVV全病毒灭活疫苗的研发、ELISA检测方法的建立及保护性抗原表位的鉴定奠定了基础。