严重急性呼吸道综合征(SARS)病毒基因组比较分析与进化研究

“严重急性呼吸道综合征”(SARS)由于危害严重，引起人们的高度重视，在各国科研人员努力下，目前已完成了十几个毒株的分离与全基因组测序工作。本研究对世界各地分离的SARS毒株的基因组全序列进行比较，发现不同毒株的同源性在99．8％以上，SARS病毒的遗传稳定性较高；将SARS病毒与其它冠状病毒基因组以及编码蛋白质序列进行比较分析，证实SARS病毒是一种新的冠状病毒，可能进化起源较早，并发现SARS病毒和牛冠状病毒同源程度最高。SARS病毒orflab、orfla、S、M、N编码区氨基酸序列和牛冠状病毒同源程度最高，鼠肝炎病毒次之。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA鉴别诊断试剂盒的研制与应用

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一种严重危害世界养猪业的重要病原菌,至少有15种血清型,根据所有血清型菌株仅在感染猪体内产生外毒素ApxⅣ的特点,建立了一种能够区分感染猪与免疫猪的鉴别诊断方法ApxⅣ-ELISA。研究在反应条件方面加以优化,将该诊断方法进一步研制成试剂盒,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试,与间接血凝试验及IDEXX公司的CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒进行了对比研究,并用该试剂盒检测了来自中国、英国、丹麦、美国、加拿大、澳大利亚等国的临床猪血清1453份。结果表明,ApxⅣ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性,与CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒的检测符合率为91.37%;3批试剂盒的批内和批间重复性良好(变异系数均<15%);试剂盒在2～8℃保存9个月内稳定性良好。所检种猪血样中,来自中国猪场1、中国猪场2、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的ApxⅣ抗体阳性率分别为30.05%、70.69%、39.72%、0.64%、42.22%、1.85%和93.94%;所检我国2个规模化猪场的仔猪ApxIV抗体阳性率分别为21.77%和27.15%,育肥猪的阳性率分别为5.51%和11.07%。研究表明,ApxⅣ-ELISA试剂盒能够有效区分APP感染猪与三价灭活疫苗或亚单位疫苗免疫猪。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因在Hela细胞中的表达及表达蛋白的定位

猪圆环病毒（Porcine circovims，PCV）属于环状病毒属，该病毒无囊膜，基因组为单链环状DNA，大小约为1．7kb，编码2个主要的开放阅读框架：ORF1和ORF2，ORF2编码病毒的核衣壳蛋白（Nawagitgul et al，2000），可能在PCV2病毒致病方面具有重要的作用。PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）．给养猪业带来了巨大的经济损失。分别用ORF2基因的亚单位疫苗免疫猪、核酸疫苗免疫小白鼠，均具有良好的效果（Blanchard et al，2003；Kamstrup et al，2004）。关于PCV2疫苗的研究在我国尚未处报道。本实验在异源启动子CMV下实现了ORF2在真核细胞中的表达。     

表达猪2型圆环病毒ORF2蛋白的重组伪狂犬病毒的生物学特性研究

为了探讨重组伪狂犬病毒TK-/gG-/ORF2 作为疫苗候选株的潜在价值,对该病毒的增殖特性、遗传稳定性、安全性、免疫原性及保护力进行了研究.结果表明:重组病毒的增殖滴度与亲本株相当,遗传稳定性良好,以100倍的免疫剂量接种小鼠时对小鼠是安全的;重组病毒在免疫小鼠后可诱导小鼠产生针对PRV和PCV2的特异性免疫应答,并且对致死剂量(100LD50)PRV Ea株强毒的攻击具有100%的免疫保护效果.     

伪狂犬病病毒Ea株gM和gN基因的克隆与结构分析

gM和Ng是最近经经典免疫沉淀法确定的伪狂犬病病毒（PRV）第三对异源糖蛋白二聚体。根据PRV国外Ka株的核苷酸序列，设计两对分别包含gM和Ng完整编码的特异性引物，以PRV国内地方分离株（Ea株）的细胞感染物为模板，PCR扩增出大小约1．2kb和0．3kb的特异性片段。将扩增物克隆到杆状病毒转座载体pEastBacl中，酶切鉴定证实后进行序列测定。结果表明：Ea株gM、Ng基因分别编码394和98个氨基酸，与Ka株的同源性分别为98．4％和97．6％。DNATool和DNASIS软件对gM、Ng进行二级结构预测，发现gM存在8个潜在跨膜区和一个N－糖基化位点，是典型的能反复多次跨膜的Ⅲ型糖蛋白；gN具有N－端信号肽序列、C－端跨膜区和潜在0－糖基化位点，属Ⅰ型糖蛋白。上述结果为下一步深入研究gM、Ng的相互作用位点及二聚体的功能奠定了功能。     

鸭源禽流感病毒的分离鉴定及特性研究

从湖北某鸭场采集泄殖腔棉拭子20份,通过传统的禽流感病毒分离方法即鸡胚尿囊腔接种法分离到1株鸭源禽流感病毒(AIV).血清学试验表明,该病毒分离株为A型流感病毒,经血凝素亚型鉴定为H9型,与禽流感病毒H9亚型标准阳性血清的血凝抑制(HI)价为8 log2,电镜负染拍照后,可清楚观察到典型的流感病毒粒子形态;致病性试验表明,该流感病毒对鸡表现为较低的致病力.研究表明,水禽,特别是鸭,正日益成为禽流感的高度易感动物,是AIV生态循环中重要的一环.     

口蹄疫病毒VP1-3免疫表位基因与猪γ-干扰素基因的融合表达

将人工合成的口蹄疫病毒VP1-3上的抗原表位基因和猪γ-干扰素基因串联入原核表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定及测序表明重组载体中二者以接头融合的形式构建成重组表达质粒。将该质粒转化BL21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,重组蛋白分子量约为66 Ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示表达的重组蛋白占菌体总蛋白的37.4%,且主要以包涵体的形式存在。包涵体以SKL变性后,经PEG4000、氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽复性。粗提产物以CPE_(50)测得重组蛋白在MDBK细胞上的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性达到1600 U/mL,说明表达产物具有干扰素的生物学活性,为下一步基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶基因的克隆、表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立

根据GenBank中的猪肺炎支原体乳酸脱氢酶（LDH）基因序列设计1对引物，PCR扩增LDH基因，首先将扩增片段连接到克隆载体pMD18-T上，然后连接到表达载体pGEX—KG上，经测序正确后诱导表达。重组质粒在大肠杆菌中表达的目的蛋白以可溶性蛋白和包涵体2种形式存在。将超声波破碎的诱导菌液高速离心，其上清用Glutathione Sepharose4Bbead亲和层析纯化。用猪肺炎支原体的标准阳性血清对纯化蛋白作Western—blot检测，出现目的条带；以纯化蛋白为抗原建立了检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA方法，该方法具有较好的稳定性和重复性，较高的特异性与敏感性。用建立的ELISA方法与中国兽医药品监察所研制的IHA试荆盒同时检测120份临床血清，二者总符合率为92．5％。用建立的ELISA方法检测了671份临床送检不同年龄阶段的猪血清，结果显示断奶前仔猪猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopnenmoniae，MHP）感染率为44．3％，保育猪为3．0％，育肥猪为17．44％，种猪为73．41％，这初步反映了猪喘气病在各个年龄阶段的感染率。