表达口蹄疫病毒P1基因的重组伪狂犬病病毒TK/gG-/PgG-P1的构建

为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础     

猪大肠杆菌水肿毒素SLT-IIeA基因的克隆和序列分析

研究以本地猪水肿病大肠杆分离物ED1株为材料 ,利用 PCR克隆了含猪水肿病大肠杆菌 (VTEC) slt-IIe A基因 987bp的片段 ,并测定了含该克隆片段的 Bam HI、Hind 酶切片段的核苷酸序列。结果表明 ,slt-IIe A基因的编码区全长 960 bp,编码 3 1 9个氨基酸的蛋白质 ,序列与国外报导的 S1 1 79株进行比较发现其核苷酸同源性为 98.9%。经推导的氨基酸序列的同源性为 99.7%。这为进一步研究 slt-IIe A的生物学特性、水肿病的分子诊断及其防制打下基础     

当前我国猪病流行动态与防治对策

一、当前猪病流行趋势 1．新的疫病不断增多,病原变异加快,毒力增强。圆环病毒中PCV2a基因组的1042核苷酸发生胸苷激酶的缺失即为PCV2b,PCV2b的毒力大于PCV2a。猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒表现Nsp2基因的部分缺失和ORF5基因糖基化位点的增加。口蹄疫病毒中传统新猪毒和泛亚毒疫苗对O型耿马属口蹄疫保护率不高。     

猪伪狂犬病病毒野毒株的分离鉴定及gC、gD基因序列分析

2019年河南某猪场暴发疑似猪伪狂犬病疫情,本试验采集发病猪的病料组织,进行伪狂犬病病毒(PRV)毒株的分离鉴定,并分析分离毒株的生物学特性。结果显示：分离毒株HNCY的TCID₅₀为10^-8.48/0.1 mL;一步生长曲线显示,分离毒株在12～24 h复制较快,48 h到达最高峰;分离毒株对小鼠具有较强的致死性,且肺脏中病毒含量最高;序列分析显示,HNCY株gC基因核苷酸序列与国内外PRV分离毒株的同源性为95.9%～100.0%,gD基因同源性为98.9%～100.0%;gC氨基酸序列与国内外PRV分离毒株的同源性为92.9%～100.0%,gD氨基酸同源性为97.5%～100.0%,且国内同源性高于国外;遗传进化分析显示,HNCY分离株gC、gD基因与欧美毒株在不同的大分支上,亲缘关系远;与国内分离株在同一分支上,且与2011年之前分离的PRV毒株在不同的小分支上,表明HNCY分离株属于国内变异毒株。     

猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达

用EcoR Ⅰ酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ 基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞.收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2 .用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证日月该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白.重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定.该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1 TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8 TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8 TCID50/0.1mL.     

四种牛分枝杆菌特异性蛋白融合表达及在牛结核病诊断中的临床应用

以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。该iELISA与导致常见牛病的非相关抗原无交叉反应。用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本,结果与ICG的符合率为93.33%(140/150)。以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国荷斯坦奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清,结果iELISA与TST的总符合率为87.32%(489/560)。对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性,iELISA与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。     

中国部分地区猪圆环病毒2型的基因型分析

对中国11个省(市)部分猪场收集的812份病料,应用ORF2-PCR进行检测,发现有235份为PCV2阳性病料.利用鉴别PCR方法从235份阳性病料中,检出10份PCV2a基因型和133份PCV2b基因型,检出率分别为4.2%、56.6%.进一步对ORF2-PCR检测阳性的部分模板进行全基因组扩增,构建阳性重组质粒,对插入质粒的片段进行测序鉴定,利用DNAStar进行同源性分析,同GenBank参考毒株绘制系统发育树,从系统发育树中也可分出PCV2a、PCV2b 2种基因型.鉴别PCR和测序结果说明,我国部分地区流行的猪圆环病毒2型以PCV2b基因型为主,少数为PCV2a基因型,也有既非PCV2a又非PCV2b的基因型(PCV2c?).     

伪狂犬病病毒感染诱导和抑制细胞凋亡

用伪狂犬病病毒 (pseudorabies virus,PRV)鄂 A株感染非免疫健康初生仔猪 ,5 d后出现典型的伪狂犬病临床症状。从感染 PRV鄂 A株仔猪的肾脏、肝脏、扁桃体、胸腺、腹股沟淋巴结、颈部淋巴结等组织细胞提取的 DNA,经琼脂糖凝胶电泳呈现大小不等的 180～ 2 0 0 bp整倍数的寡核苷酸片段梯状条带 ,经 PCR方法鉴定为 PRV DNA。末端脱氧核苷转移酶原位标记 [terminal deoxynucleotidyl transferase(Td T) - conjugated d UTP nick end labelling,TUNEL ]法显示 ,部分凋亡的阳性细胞呈现染色质凝聚、细胞核固缩、染色质靠核膜边聚集等形态学变化 ,说明 PRV诱导细胞凋亡是造成急性感染时组织器官广泛损伤的重要原因之一 ;而 PRV感染的大脑、小脑、嗅球及脊髓等神经系统组织中未观察到上述细胞凋亡特征 ,说明 PRV可以抑制急性感染时神经细胞发生凋亡。本试验结果显示 ,在 PRV急性感染状态下 ,病毒诱导细胞凋亡是杀伤细胞的重要途径之一 ,同时这一过程又可通过神经系统病毒基因隐性感染及潜伏期的建立而受到抑制     

一起母猪繁殖障碍疾病的诊断

以流产、木乃伊和死产为主要特征的繁殖障碍给现代养猪业带来巨大的危害.母猪的繁殖障碍主要包括不育、空怀、屡配不孕、返情、死胎、流产、产弱仔和畸形胎等.引起母猪繁殖障碍的因素主要有两类:一类是引起生殖道原发性感染的病原(传染性因素),约占30%～40%;另一类是毒素、环境和营养等非传染性因素,约占60%～70%.但是,往往以传染性因子(尤其是病毒)的影响更加令人关注,其中影响较大的有PRV、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪瘟病毒(HCV).这些病毒所致疾病症状相似,都可以通过胎盘感染胎儿,进而影响胎儿的发育和存活.     

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

用PCR方法配合生化鉴定，从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis，PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)。然后做了药敏试验，并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测，用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenie Pasteurella multocida，T^ Pm)进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致；PCR分型表明有46株为D型Pm，18株为A型：Pm，1株为B型Pm，1株无法定型；有8株用PcR检测为T^ Pm；豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T^ Pm的进一步鉴定也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8株T^ Pm都为D型，都分离于有严重PAR症状的猪。