大菱鲆MKK基因家族全基因组鉴定及其在生物和非生物应激下的表达分析

为了阐明大菱鲆丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinases,MAPKKs或MKKs)基因家族在生物和非生物应激响应中的作用,本实验首先通过生物信息学方法对大菱鲆MKK基因家族进行了全基因组水平的鉴定,利用多个应激相关转录组数据集分析了大菱鲆MKK家族成员在不同组织及不同生物和非生物应激下的表达模式。结果显示,本研究在大菱鲆全基因组水平上共鉴定出9个MKK基因家族成员,它们不均匀地分布在7条染色体上,并分别对其编码蛋白的理化性质、蛋白二级结构和亚细胞定位进行了预测。基于系统发育分析,将SmMKKs划分为5个亚家族。内含-外显子结构、保守基序和多重序列比对分析结果不仅为大菱鲆MKK亚家族分类提供了证据,而且表明SmMKKs在进化上高度保守。SmMKKs在不同组织及不同生物和非生物应激下的基因表达模式分析表明,SmMKKs具有明显的组织特异性表达。另外,结果显示,粘孢子虫和肿大细胞病毒感染后,SmMKK6a呈极显著差异表达;热应激处理后,SmMKK6a呈极显著差异表达;高盐或低盐胁迫后,SmMKK4a、SmMKK4b、SmMKK6a...     

半滑舌鳎Cs-UBE2D4基因的克隆、表达模式及启动子活性

泛素-蛋白酶体系统作为重要的蛋白质修饰途径,参与多个生物学过程,其中泛素结合酶E2作为关键酶可以决定泛素化对靶蛋白的影响。为了探究泛素结合酶E2在半滑舌鳎雌性性腺发育中的作用,本研究克隆了半滑舌鳎Cs-UBE2D4基因的开放阅读框ORF,检测了该基因在不同组织和不同发育阶段性腺中的表达模式;构建了其启动子报告基因载体(pGL3-Cs-UBE2D4)并进行了启动子活性分析。Cs-UBE2D4开放阅读框为360 bp,编码119个氨基酸,含有保守的泛素结合酶E2结构域。荧光定量PCR结果显示,Cs-UBE2D4在雌鱼的各组织中广泛表达,其中在卵巢和肝脏中表达量较高,而在雄鱼中几乎检测不到表达;在卵巢各发育阶段中,该基因的表达量从90日龄开始上调,6月龄达到峰值,之后开始下调,在1.5龄时表达量最低,在3龄时表达量有所回升,其中6月龄表达量为90日龄表达量的1.97倍。双荧光素酶活性检测结果显示,Cs-UBE2D4启动子具有较强的转录活性。本实验将为进一步开展Cs-UBE2D4基因对半滑舌鳎卵巢发育和性别调控相关机制的研究提供理论依据。     

异源精子诱导犬齿牙鲆的雌核发育

用冷冻保存的花鲈精子作为异源精子,采用紫外线(UV)对精子进行照射使其遗传物质失活,然后与卵子进行授精,可以刺激犬齿牙鲆鱼卵进行雌核发育,在受精后一定时间采用冷休克处理授精卵,抑制第二极体排出成功获得了犬齿牙鲆雌核发育二倍体鱼苗.实验表明:犬齿牙鲆同源精子经80 mJ/cm2的紫外线照射可以完全失活,冻存花鲈精子经紫外线照射后也同样具有诱导犬齿牙鲆雌核发育的能力.无论同源精子还是异源精子,最佳诱导条件为在18℃条件下,精子经80 mJ/cm2的紫外线照射,受精后4～5 min将受精卵放在3℃海水中进行冷休克处理,持续时间为45 min,同源精子和异源精子二倍体诱导分别为32.66%±7.03%和28.00%±6.48%.采用形态学、流式细胞仪DNA含量分析和微卫星标记技术对雌核发育鱼苗进行了分析,证明了雌核发育鱼苗为雌核发育二倍体.     

半滑舌鰨养殖群体雌雄比例与自然性逆转率

利用半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）性别连锁微卫星标记scaffold1128₃43和性腺组织切片的方法,研究半滑舌鳎8个普通家系和养殖场雄性亲鱼遗传性别与性逆转情况。首先,8个普通家系（28、30、38、39、40、44、57、69）遗传性别检测结果显示,遗传雌性比例最低为39家系（37.93%）,最高为38家系和40家系（55.00%）。对其中4个家系（28、39、44、57）的两次遗传性别比例检测结果对比发现,家系间遗传雌性比例存在差异。其次,对4个家系（28、39、44、57）和养殖场雄性亲鱼的遗传与表型性别鉴定结果表明,不同家系表型雌鱼比例为18.75%⁴6.88%,低于各家系的遗传雌性比例,不同家系间自然性逆转率存在显著性差异（P<0.05）。研究还发现,繁育场所用的普通雄性亲鱼中平均有28.42%的伪雄鱼。本研究结果表明,自然性逆转现象在半滑舌鳎养殖群体中普遍存在,半滑舌鳎不同家系的表型雌鱼比例存在显著差异,这为培育半滑舌鳎高雌性苗种提供了理论依据。     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因在成鱼组织和不同发育时期胚胎中的表达分析

抗菌肽hepcidin是由hepcidin基因编码产生的小分子多肽,是机体天然免疫的重要因子。本文利用RT-PCR的方法分析表明,抗菌肽hepcidin基因在牙鲆成鱼不同组织和不同发育时期胚胎中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。     

“学、建、树、提”活动对党员干部作风建设的作用探讨

结合基层工作经验,对基层开展"学、建、树、提"活动所起的作用进行探讨,确定了活动的效果,同时也指出了活动开展中所存在的问题。     

半滑舌鳎响应急性高温胁迫的生理变化和相关基因表达

夏季高温会引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的应激,甚至造成死亡,是工厂化养殖的重要影响因素之一。为探究高温胁迫对半滑舌鳎肝脏氧化损伤及热应激相关基因的影响,本研究选取半滑舌鳎一个全同胞家系为实验对象,通过连续升温达到高温胁迫条件(35 ℃)后,分别在0、3、6、12和24 h采集肝脏组织,进行苏木精–伊红染色法(HE)和TUNEL染色并观察细胞损伤情况,测定抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量并检测应激相关基因heat shock protein family A member 1A (hspa1a)、heat shock protein 90 beta family member 1 (hsp90b1)和dual-specificity phosphatase 1 (dusp1)的表达变化。结果显示,急性高温胁迫会造成半滑舌鳎肝脏组织发生明显病理变化并出现细胞凋亡;超氧化物歧化酶(SOD)活性在高温胁迫6 h时显著高于对照组(P<0.05),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性在高温胁迫12 h时显著高于对照组(P<0.05),过氧化氢酶(CAT)活性在高温胁迫0 h时显著高于对照组(P<0.05),MDA含量在高温胁迫24 h时显著高于对照组(P<0.05);热休克蛋白基因hspa1a和hsp90b1分别在高温胁迫0 h和3 h时显著上调表达,热应激相关基因dusp1在高温胁迫3 h时显著上调表达。综上所述,急性高温胁迫下,半滑舌鳎肝脏发生氧化应激,短期内机体可调动抗氧化系统加速清除活性氧,并激活热应激相关基因表达。该研究可为解析半滑舌鳎对高温胁迫的响应机制、预防夏季高温大规模死亡的发生以及开展耐高温良种的选育等提供参考。     

豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传参数分析

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)患“烂身病”的主要致病菌,每年6―8月发病率极高,严重影响了该品种养殖业的可持续发展。因此,培育抗病良种是豹纹鳃棘鲈养殖业的迫切需求。为评估豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传参数,本研究基于高密度单核苷酸多态性位点构建的基因组亲缘关系矩阵,使用4种模型(BLM、BTM、LLM和LTM)拟合了2种抗病表型(测试日性状,TDS;二元死亡存活性状,TS),并用约束最大似然法(REML)估算方差组分。经分析,豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传力为0.182~0.486,属中高遗传力性状,加性遗传方差为0.071~0.262。其中,利用线性模型(BLM和LLM)估算的遗传力分别为0.382和0.476,利用阈值模型(BTM和LTM)估算的遗传力分别为0.182和0.207。表明可以通过遗传选育提高豹纹鳃棘鲈抗弧菌能力。对不同模型估算的基因组估算育种值(GEBV)进行相关性分析,不同模型拟合同种抗病表型时,GEBV之间相关系数> 0.9,属于高强度正相关关系,表明使用同种表型定义时,阈值或线性模型对GEBV排名影响很小。对不同模型估算的GEBV与不同表型进行相关性分析的结果显示,纵向模型(LLM和LTM)估算的GEBV与表型TS之间的相关系数高于横截面模型(BLM和BTM),说明表型TDS可能比表型TS更适合作为抗病表型。此外,在线性模型中,使用表型TDS和表型TS估算的GEBV之间的相关系数< 0.85,说明采用2种表型定义下估计的豹纹鳃棘鲈抗哈维弧菌GEBV排名不一致。但基于表型TDS估算的GEBV与表型TS之间的相关系数较强(0.824),表明使用表型TDS和纵向模型(LLM)估算豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传参数更有优势。本研究补充了豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌遗传参数研究,为豹纹鳃棘鲈抗哈维氏弧菌良种选育提供了参考。     

钝吻黄盖鲽精子冷冻保存及生理特性分析

钝吻黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)是鲆鲽鱼类中重要的天然捕捞和养殖对象,但由于生态环境变化、人工捕捞过度等因素,导致其种质资源数量降低,进行精子冷冻保存技术研究,对其种质资源保存具有重要意义.本研究以性成熟的雄性钝吻黄盖鲽为实验材料,对精子稀释液种类及成分、抗冻剂种类、激活精子海水盐度和冷冻精液授精实验等进行筛选,实验数据利用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和Student-Newman-Keuls分析.结果表明,利用MFs-3(8 g/L NaCl+0.65 g/L KCl+15 g/L Glucose)稀释液分别与20％1,2丙二醇(1,2-propylene glycol,PG)和20％乙二醇(ethylene glycol,EG)抗冻剂作为精子抗冻保存液时,冷冻效果最好,其中PG组对应的精子活力、快速运动时间和寿命分别为(95.26±0.39)％、(46.00±1.00)s和(124.33±4.04)s,EG组则为(95.15±0.41)％、(45.67±0.58)s和(124.00±3.00)s.利用盐度为10～50的人工配制的海水激活解冻后的精子,发现当盐度为30时,精子活力高达(95.07±0.69)％,与对照组相比不存在显著性差异.将PG组和EG组冷冻保存的精子解冻后分别与其卵进行授精实验,PG组受精率和孵化率为(80.08±0.68)％和(77.44±1.76)％,EG组则为(80.17±0.45)％和(77.92±1.33)％,与鲜精相比无显著性差异.利用计算机辅助精子分析系统(computer-aided sperm analysis,CASA)测定MFs-3+20％ PG和MFs-3+20％ EG冷冻保存的钝吻黄盖鲽精子的各项运动参数,结果显示,二者的曲线运动速度(curvilinear velocity,VCL)、直线运动速度(straight line velocity,VSL)、平均鞭打频率(beat cross frequency,BCF)、运动的直线性(linearity,LIN)和运动的前向性(straightness,STR)的数值差异性不显著.本研究利用MFs-3+20％ PG和MFs-3+20％ EG成功冷冻了钝吻黄盖鲽的精子,为钝吻黄盖鲽精子冷冻保存技术、人工杂交育种繁殖及种质资源库的建立奠定了基础.     

星斑川鲽精子冷冻保存与生理特性分析

针对星斑川鲽(Platichthys stellatus)养殖群体中雄性个体较雌性小,产精液量低,限制了人工繁殖育苗和杂交育种开展等问题,本研究以性成熟的星斑川鲽为实验材料,对精子稀释液成分、稀释液渗透压、激活海水适宜温度和冷冻精液的适宜稀释比例等进行筛选,并用冷冻精液和鲜精分别与星斑川鲽卵进行受精和孵化实验,实验结果利用SPSS软件中单因素方差分析法和Student-Newman-Keuls进行比较分析。结果表明,利用Ts-2(37.65 g/L蔗糖+10.01 g/L KHCO3+1.21 g/L Tris碱)和SFs-4(60 g/L葡萄糖+10.01 g/L KHCO3+1.21 g/L Tris碱)冷冻保存的精子活力最高,分别为(56.67±5.78)%和(66.67±5.77)%。利用计算机辅助精子分析(computer assisted sperm analysis,CASA)系统对星斑川鲽精子进行分析,测定了用Ts-2和SFs-4保存的冷冻精液中精子运动方式的各项参数。结果显示,测定的各项参数(曲线运动速度(curvilinear velocity,VCL)、直线运动速度(straight line velocity,VSL)、平均鞭打频率(beat cross frequency,BCF)、运动的直线性(linearity,LIN)和运动的前向性(straightness,STR)表明,利用SFs-4保存的精子各项运动参数明显高于Ts-2。利用蔗糖、KHCO3和Tris碱配制不同渗透压稀释液中,在渗透压为319.94 Pa时,精子活力最高,为(61.67±5.00)%,与鲜精相比无显著差异(P0.05)。利用3~18℃海水激活精子,结果显示,当激活海水温度在12℃时精子活力最高,与鲜精相比无显著性差异(P0.05),而其他温度下显著低于鲜精活力(P0.05)。将解冻后的精液稀释10~40倍,与星斑川鲽卵受精,结果显示,在稀释20倍后冷冻精液的受精率最高。本研究利用Ts-2+20%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)和SFs-4+20%DMSO对星斑川鲽精子成功进行冷冻保存,为星斑川鲽精子冷冻保存、种质库的建立和应用提供理论和技术依据。