橡胶树C-乳清三种蛋白提取方法双向凝胶电泳分析

摘要：C-乳清是胶乳的主要组分,就双向凝胶电泳技术而言,目前仍无有效的蛋白提取方法,这严重制约了双向凝胶电泳技术在橡胶树蛋白组分析上的应用。本文选取3种方法提取C-乳清蛋白,通过对蛋白产量和提取蛋白的双向凝胶电泳图谱分析系统评价3种方法。就蛋白产量而言,三氯乙酸/丙酮沉淀法产量最高（0.86 mg/ml C-乳清）,三氯乙酸沉淀法次之（0.72 mg/ml C-乳清）,酚提取法最低（0. 66 mg/ml C-乳清）。双向凝胶电泳图谱分析表明：酚提取法可检测到447个蛋白点,图谱背景较暗且横纵向纹理多;三氯乙酸沉淀法可检测到821个蛋白点,图谱背景居中;三氯乙酸/丙酮沉淀法可检测到1052个蛋白点,图谱背景清晰且基本无纹理。综上所述,三氯乙酸/丙酮沉淀法最适合C-乳清蛋白提取。本文首次系统评价C-乳清蛋白提取方法,必将推动橡胶树C-乳清蛋白研究发展。     

利用oligo芯片技术鉴定橡胶树死皮相关基因

橡胶树死皮（Tapping Panel Dryness,TPD）是天然橡胶单产提高的主要限制因子之一,给橡胶种植业带来严重危害。本研究利用定制橡胶树oligo芯片,通过提取死皮和健康橡胶树胶乳总RNA,标记并反转录成cDNA后与橡胶树oligo芯片进行杂交鉴定TPD相关基因,利用RT-PCR技术对芯片结果进行验证。对芯片数据分析结果显示,以2倍标准在死皮与健康橡胶树间筛选到26个差异表达基因,其功能涉及橡胶生物合成、细胞程序性死亡、细胞抗性及防御反应、活性氧代谢、DNA甲基化、泛素-蛋白酶体、信号传导、蛋白质合成、加工及转运等调控途径。进一步的RT-PCR验证结果表明,随机选取12个基因的表达模式均与芯片结果一致。本研究为大规模鉴定TPD相关基因和揭示TPD发生分子机制奠定了基础。     

橡胶树肌动蛋白解聚因子的表达和功能鉴定

为探寻肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor,ADF)在调控肌动蛋白解聚和聚合平衡过程中发挥的作用,从橡胶树中获得了Hb ADF基因组序列,经测定,该序列长2 258 bp,含有2个内含子和3个外显子,在裂殖酵母中过表达Hb ADF,获得相对分子质量约38 000的融合蛋白。对裂殖酵母细胞形态进行观察,发现诱导表达Hb ADF的酵母细胞长度显著增加,双核和多核比例达67%。实时荧光定量PCR结果表明,Hb ADF的表达受3%KI处理调控,在橡胶树不同死皮阶段和不同排胶时间段的表达存在变化,说明Hb ADF可能参与了橡胶树排胶和死皮的过程。     

巴西橡胶树HbUBC5基因克隆、生物信息学及表达分析

为研究巴西橡胶树泛素结合酶(UBC)基因功能,采用PCR技术从巴西橡胶树中克隆了一个UBC基因,用半定量RTPCR分析基因表达模式,同时对基因编码蛋白进行生物信息学分析。结果表明,基因长681 bp,最长开放阅读框555 bp,预测编码蛋白包含184个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC5(At1g63800)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC5。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC5在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在树皮中表达最低。HbUBC5在叶片不同发育时期表达模式存在变化,在古铜期最低,在稳定期最高。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC5表达量明显下降。HbUBC5表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC5可能在巴西橡胶树死皮、产排胶、乙烯和茉莉酸反应中发挥作用。     

天然橡胶合成关键酶基因Hmg1启动子克隆与序列分析

在巴西橡胶树天然橡胶的生物合成途径中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-Hydroxy-3-MethylglutarylCoenzymeAReductase,HMGR)是关键酶之一,为了利用其基因的启动子和瞬时表达系统来筛选促进橡胶树生物合成的调节剂,利用GenomicWalking方法从高产树热研7-33-97的叶片基因组DNA中克隆了Hmg15′端调控序列。序列分析结果表明,巴西橡胶树Hmg1启动子转录起始位点的保守序列CTCATCA,与其他植物基因的非常一致;在5′端调控序列中发现几个典型的真核生物顺式调控元件TATA-motif、CAAT-motif、CGTCA-motif、ERE等。用克隆得到的Hmg15′端启动子序列分别替换了pCAMBIA1302中的CaMV35S启动子,构建了序列缺失pCAMBIA1302表达载体pCAMBIA1302H900、pCAMBIA1302H500和pCAMBIA1302H300。     

伤害对巴西橡胶树胶乳中磷脂酶A2的影响

以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Mull.Arg.）无性系PR107和热研7—33—97为试验对象,研究机械伤害、外源莱莉酸及乙烯（利）等条件对胶乳C-乳清中磷脂酶A2的影响。结果表明,伤害和外源莱莉酸及乙烯（利）对磷脂酶A2均有诱导作用。其中机械伤害的诱导效应最为明显,外源茉莉酸最适诱导浓度为0.08％,磷脂酶A2活性随着外源乙烯刺激剂量的增加而增强。伤害信号能在伤害早期较明显地诱导磷脂酶A2的活性。     

拟南芥MAPKKK16酵母双杂交诱饵载体的构建及毒性和自激活效应检测

前期研究发现,橡胶树MAPKKK基因与抗寒相关.通过同源比对发现,拟南芥MAPKKK16与橡胶树抗寒基因MAPKKK高度同源,但拟南芥MAPKKK16的功能及其调控机制仍不清楚.为了筛选拟南芥MAPKKK16基因的互作蛋白,利用PCR技术从拟南芥基因组DNA中扩增出拟南芥MAPKKK16基因的目的片段,随后亚克隆到pG...