玉米株型性状的QTL定位

以玉米自交系L26和095组配的F2世代为作图群体,采用SSR分子标记技术和复合区间作图法对玉米茎粗等7个株型性状进行基因定位。共检出21个QTL,其中茎粗检测到1个位点(qSD1),穗位高、株高均检测到3个QTL位点(qEH1-qEH3、qPH1-qPH3),雄穗分枝数检测到5个QTL位点(qTBN1-qTBN5),叶片数检测到4个QTL位点(qLN1-qLN4),叶型系数检测到3个QTL位点(qLSC1-qLSC3),叶向值检测到2个QTL位点(qLOV1-qLOV2)。21个QTL中,qTBN1、qTBN4、qLN1、qLN3、qLN4这5个QTL解释表型变异率超过30％,表现出明显的主效QTL效应。研究还发现,有5个影响不同性状的QTL位于染色体上相同标记区间内或与相同标记连锁,分为Ch3-2和Ch8-1两个区段,表现出了成簇分布的特性。     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

种植密度对不同株型玉米蔗糖代谢和淀粉合成相关酶活性的影响

试验选取平展型玉米"长玉13"、半紧凑型玉米"东单60"和紧凑型玉米"郑单958"为材料,分别在2600株·667m-2、3200株·667m-2、3800株·667m-23种密度下种植,探讨种植密度对不同株型玉米灌浆过程中功能叶蔗糖代谢和籽粒淀粉合成相关酶活性的影响。结果表明,种植密度对功能叶片蔗糖含量、磷酸蔗糖合成酶和蔗糖合成酶活性影响较大,高密度不利于功能叶片中蔗糖的合成,低密度有利于蔗糖积累;而籽粒中的淀粉合成相关酶——ADPG焦磷酸化酶和UDPG焦磷酸化酶活性受种植密度影响较小;平展型"长玉13"和紧凑型"郑单958"是源端限制型品种,而半紧凑型"东单60"是库端限制型品种;种植密度对不同株型玉米品种的影响程度有差异,对平展型"长玉13"影响最大,而对紧凑型"郑单958"影响最小。     

利用CRISPR/Cpf1系统构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的293T细胞株

【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。