蔗糖转运蛋白VvSUC11和VvSUC12累加作用对提高转基因甜菜含糖量的影响

【目的】甜菜是重要的糖料作物,块根中的蔗糖含量是其品质的决定因子。利用基因工程技术将葡萄蔗糖转运蛋白基因（VvSUC11和VvSUC12）导入甜菜块根中,以了解蔗糖转运蛋白是否能提高甜菜的含糖量。【方法】利用葡萄蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12构建的根特异性表达植物双价表达载体（pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12）,通过农杆菌介导法转化到甜菜（Beta vulgaris L.）品种KWS-9103中。利用PCR和RT-PCR技术检测目的基因是否整合到甜菜中并表达。将获得的转基因甜菜和对照甜菜生根后移栽大田,对其叶片性状、相关的生理指标、块根重和含糖量进行测定。【结果】通过PCR和RT-PCR检测,获得13株转基因甜菜。测得转基因植株叶长、叶宽、叶柄长和叶片数量平均分别为25.16 cm、19.31 cm、29.17 cm和38.33个,与对照相比,叶宽增加31.81%,叶柄缩短16.61%,叶片数目增加17.04%,都存在极显著差异,而叶长增加1.68%,无显著差异;叶绿素a含量（1.31 mg•g-1）、叶绿素b含量（0.562 mg•g-1）和叶绿素总含量（1.87 mg•g-1）与对照无显著差异;叶中可溶性糖含量（14.59 mg•g-1）降低13.04%,与对照（16.51 mg•g-1）存在极显著差异,叶柄中可溶性糖含量（21.90 mg•g-1）增加3.36%,但与对照（21.6 mg•g-1）差异不显著;单株转基因甜菜的块根重和含糖量分别平均为3.067 kg和183.2 g•kg-1,与对照（2.894 kg）相比,块根增重5.91%,差异不显著,含糖量增加9.41%,与对照（167.5 g•kg-1）存在显著差异。说明转基因甜菜叶面积和叶片数的增加,扩大了其光合叶面积,同时叶柄缩短有利于提高糖分子从源叶到库的转运,促进甜菜块根的形成和加快糖分的积累。【结论】利用蔗糖转运蛋白VvSUC11、VvSUC12能够有效地提高转基因甜菜的含糖量。     

棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

摘要：乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步,是脂肪酸合成的限速酶。本研究采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase羧基转移酶β-CT亚基编码基因accD,ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组,构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥,收种子,在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草,经不定芽诱导、生根培养,获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录。     

棉花αccD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

转基因烟草植株.T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录.     

陆地棉GAI基因原核表达与多克隆抗体制备

 DELLA蛋白是GA信号响应的关键负调节因子,本文采用基于EST的电子克隆方法,从棉花中克隆了DELLA蛋白家族的一个成员GhGAI。根据电子克隆序列,从陆地棉花胚珠cDNA中扩增得到GhGAI全长基因片段。将其在原核中表达,得到了分子量（Mr）为62000的蛋白质条带。表达蛋白经His-Tag亲和层析纯化后,对兔子进行免疫,制备的抗血清通过间接ELISA检测,具有较高的效价和特异性。     

CAC3基因转运肽序列和accD基因融合植物表达载体的构建

采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出Accase羧基转移酶β-CT亚基编码基因accD,Accase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列.分析结果与NCBI公布的氨基酸同源性分别为100%,99%.将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组,构建了融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD,为下一步作物的遗传转化打下了基础.     

棉蚜唾液腺蛋白 armet 基因的克隆及表达特性分析

armet是一种水溶性唾液蛋白,在蚜虫取食过程中具有重要作用。本研究结合棉蚜的转录组分析结果,以注释的armet基因转录本作为参考,克隆得到棉蚜的armet基因(GenBank登录号KY612465)。armet基因的开放阅读框为522bp,编码173个氨基酸。在其氨基酸序列的N端具有一个由21个氨基酸组成的信号肽。在其氨基酸序列的C-末端具有内质网滞留信号KDEL。运用RT-qPCR分析棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜的时间表达谱,结果表明,armet基因的表达量在除3日龄成蚜外的各个时期均稳定表达,在两种专化型棉蚜中表达量相当,说明armet基因可能在棉蚜整个生命活动过程中均起重要作用。分别将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜转接到西葫芦Cucurbita pepo L.后,通过荧光定量PCR检测armet基因在转接寄主前后表达量的变化,结果显示armet基因在转接第2代3日龄黄瓜型成蚜中的表达量显著高于转接前,在其他转接试验中转接前后表达量有变化,但未达到显著水平,说明armet基因在不同专化型棉蚜寄主转接试验的成、若蚜中发挥不同作用。     

含有MAR序列的STI-STII-LTB融合基因在苜蓿中的表达

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用三引物PCR法和酶切实现了STI、STII、LTB基因的融合,LTB基因的5′位于STII基因的3′端,三者在同一阅读框。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中GUS基因的位置。同时构建不含MARs序列的重组质粒。重组质粒pBI121-MARs-STI-STII-LTB、pBI121-STI-STII-LTB通过冻融法转化根癌农杆菌,并通过农杆菌介导法转化杂花苜蓿。转基因苜蓿植株经PCR检测、Southern-blotting分析表明,转基因苜蓿植株基因组中可检测到STI-STII-LTB融合基因;提取转基因苜蓿植株总蛋白质,SDS-PAGE结果显示,转基因植株表达了重组抗原蛋白,且含MAR序列的蛋白表达量要高于不含MAR序列的表达量;Western-dotting免疫检测证实转基因植株表达的重组抗原具有免疫原性。     

不同化学防腐剂及植物提取物对组培中常见真菌抑制效果研究

目的:研究化学防腐剂及植物提取物在单一及复配条件下对组织培养过程中常见霉菌的抑制效果,为防腐剂降低组培污染率提供依据。方法:利用涂布平板法测定单一及复配防腐剂对青霉和黑曲霉的抑制作用。结果:肉桂酸钾、尼泊金复合酯对青霉和黑曲霉抑菌效果优于丙酸钠、山梨酸钾,最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentrations,MIC)分别为0.040%、0.035%;大蒜提取物、阿魏提取物、薰衣草精油的抑菌效果优于孜然提取物,MIC分别为0.9%、1.4%、0.35%。与单个防腐剂相比,复合防腐剂抑菌效果更好。通过尼泊金复合酯、肉桂酸钾和大蒜提取物3因素正交试验设计,发现对青霉抑制最优组合浓度分别为0.02%、0.03%、0.2%,或0.03%、0.03%、0.15%,对黑曲霉抑制最优组合浓度分别为0.03%、0.02%、0.2%。结论:采用防腐剂与植物提取物复配方式可以抑制霉菌孢子萌发及菌丝生长,在降低组培污染率具有较好的应用前景。     

羽毛针禾组织培养方法研究

[目的]筛选适合于羽毛针禾种子发芽的培养基及愈伤组织诱导培养基。[方法]以羽毛针禾种子为基础材料,以MS培养基为基本培养基,研究不同激素浓度配比条件下种子发芽率及愈伤组织的诱导效果。[结果]6-BA对羽毛针禾种子的萌发作用不太明显,但加入6-BA后有利于种子个体的生长发育;GA3对羽毛针禾种子的萌发起着关键性的作用。种子发芽最适培养基为1/2 MS+GA32.0 mg/L,可诱导出结构致密、绿色颗粒状胚性愈伤组织。较高浓度的2,4-D可促进愈伤组织较快发生,但浓度过高对胚性愈伤组织的诱导有抑制作用且容易导致愈伤组织的褐化现象,只有当2,4-D浓度为2.0 mg/L时,胚性愈伤组织的诱导率达最大值,得到最好的培养效果。种子愈伤组织的诱导以MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L为宜。[结论]为完善羽毛针禾的高频再生体系和基因转化奠定了基础。     

拟南芥At3g28220基因抗寒功能初步分析

采用RT-PCR分析、基因克隆、转化等方法对At3g28220基因功能进行了研究.结果发现At3g28220基因在拟南芥受到低温及盐胁迫时才会在拟南芥中表达,且在不同生长期不同器官中的表达量无明显差异.通过构建35s:At3g28220基因正反向表达载体转化拟南芥,T1植株经卡那霉素抗性筛选,RT-PCR检测,结果表明At3g28220基因已经整合到拟南芥基因组中,并在转录水平表达.正常生长条件下,转基因拟南芥与野生型拟南芥的生长未见明显区别,而经过低温胁迫研究发现,正向表达转基因拟南芥的冷冻耐受能力明显高于野生型植株.说明拟南芥hos10-1冷驯化能力的丧失是与At3g28220基因的表达下调有直接的关系.