Tgf2转座系统在转RFP基因斑马鱼上的应用

提高目的基因的转植效率与可遗传效率是转基因鱼研制的关键点之一。本研究利用近年开发的金鱼转座子系统进行转基因斑马鱼的研制,探讨其在转基因鱼上应用的可行性。通过PCR方法,改造Tgf2转座子供体质粒pTgf2-EF1α-eGFP,将肌球蛋白轻链2启动子(mylz2)与红色荧光蛋白基因(RFP)定向插入其中,构建可在肌肉组织特异性表达红色荧光蛋白的Tgf2转座子供体质粒pTgf2-Mylz2-RFP。通过显微注射,将Tgf2转座子供体质粒与Tgf2转座酶mRNA共注射于斑马鱼(Danio ririo)受精卵中,共注射受精卵972粒,出膜后存活的仔鱼803尾,其中携带外源基因的仔鱼为615尾,阳性率为76.6%。转红色荧光蛋白基因斑马鱼首代F0培育至性成熟,将其中的10尾F0斑马鱼分别与野生型斑马鱼进行配对繁殖,其中1个组合产生了体表呈现均匀红色荧光的F1个体,因此RFP在F0的整合率为10%。将红色荧光F1个体培育至性成熟并与野生型鱼配对繁殖,F2的阳性个体占69%。本研究结果说明,由Tgf2转座子介导的转基因技术,可有效提高目的基因的转植效率与整合效率,在转基因鱼构建以及相关研究中具有开发应用前景。     

尼罗罗非鱼微卫星标记与主要生长性状的相关性分析

为了筛选到与尼罗罗非鱼生长相关的分子标记,并对这些标记进行准确性鉴定,运用65个微卫星标记对鹭业和番禺2个尼罗罗非鱼群体进行了PCR扩增,再利用SPSS软件一般线性模型(GLM)对这些微卫星位点与尼罗罗非鱼体重等主要生长性状进行了标记性状连锁关联分析。结果表明,鹭业群体中有8个微卫星标记(UNH130,UNH183,UNH911,GM558,UNH211,UNH176,UNH914和UNH974)与主要生长性状显著或极显著相关(P<0.05或P<0.01),其中有2个微卫星标记(UNH914和UNH974)与番禺群体的主要生长性状显著或极显著相关(P<0.05或P<0.01),1个微卫星标记(UNH176)只与体重显著相关(P<0.05)。通过对与生长性状相关标记的基因型和表型值进行多重比较,得到了对体重、体长和体高3种性状有利的基因型或等位基因。发现了对罗非鱼生长性状有显著效应的微卫星位点,为开展罗非鱼的分子标记辅助育种提供了有价值的遗传标记。     

转红色荧光蛋白基因唐鱼的遗传分析和生物学研究

转红色荧光蛋白基因唐鱼(Tanichthys albonubes)测交获得实验鱼,以表达红色荧光蛋白为表型性状,采用点杂交和遗传学分析相结合的方法,研究外源基因的遗传传递规律,并对转基因唐鱼和非转基因唐鱼的生长和繁殖等方面进行了比较.结果显示:测交后代表型的分离规律基本符合经典的孟德尔单显性基因遗传模式,外源基因属于单位点整合,测交后代中没有发现沉默整合个体;实验鱼的生长和可量性状对比实验表明,转基因唐鱼和非转基因唐鱼在仔鱼期到性成熟之间,生长速度无显著差异,性成熟个体的外部形态除体色外也无差别,繁殖力方面基本无显著差异.本研究结果表明了培育转红色荧光蛋白基因唐鱼纯系的可行性;同时在生长、繁殖方面的研究结果为评价转基因唐鱼的生态安全奠定了基础.     

微卫星DNA标记在大口黑鲈亲权鉴定中的应用

【目的】探讨微卫星DNA标记在大口黑鲈(Micropterus salmoides)亲权鉴定中的可行性,为大口黑鲈家系选育的系谱精确鉴定和选育效果评价提供依据。【方法】选择12个多态信息含量较高的微卫星DNA位点,以人工选育建立的大口黑鲈5个全同胞家系为试验材料,采用Cervus 3.0进行亲权分析,并根据家系内个体间的遗传距离进行UPGMA聚类分析。【结果】所选的12个微卫星DNA多态位点在102个子代中的平均等位基因数(A)为3,平均观测杂合度(Ho)为0.594 8,平均期望杂合度(He)为0.545 7,平均多态信息含量(PIC)为0.475 9。Cervus3.0亲权分析表明,在置信度为95%时,使用12个和10个位点,模拟和实际分析的判别成功率分别为96%和98%,87%和91%;而置信度为99%时,分别为78%和92%,64%和86%;在置信度为99%和95%时,判别准确率皆在90%以上。从12个位点中挑选10个多态信息含量高的微卫星DNA位点,即可将102个子代完全准确地聚为5个群体。亲权分析结果与聚类分析结果一致。【结论】所选用的12个微卫星位点可用于大口黑鲈亲权鉴定研究,其判定成功率和准确率较高,结果可靠。     

大口黑鲈POU1F1启动子区域SNPs对生长的影响

采用基因组步移技术克隆了大口黑鲈垂体特异性转录因子POU1F1启动子序列,该序列全长1 629 bp,预测存在4个八聚体转录因子1(Oct-1)结合位点和TATA框等基本转录元件,1个Homeobox转录因子结合位点和2个cAMP反应元件结合蛋白(CREB)结合位点。采用直接测序法研究发现,大口黑鲈POU1F1启动子序列的-18和-183两个位点存在SNPs,该两个突变位点只检测到A、B两种单倍型。对养殖群体进行不同单倍型的基因频率和生长关联分析,结果表明,单倍型A的等位基因频率为0.246,单倍型B的等位基因频率为0.754;群体关联分析表明,基因型为AA型和AB型的个体在体质量、体长、全长、体高和体宽等方面明显高于BB型个体,但基因型为AB型和AA型的个体之间在体质量方面没有明显差异。该研究结果为下一步进行分子标记辅助选择提供了基础。     

基因重组cystatin对鲢鱼糜肌球蛋白的保护作用初探

研究了基因重组中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂(recombinantChinesesturgeoncystatin)基因在毕赤酵母中的表达和以鲢为原料制作鱼糜过程中添加与未添加recombinantcystatin情况下肌球蛋白的含量变化趋势。结果表明重组cystatin对木瓜蛋白酶具有较强的抑制活性,曲线方程为y=0.0234x 0.0059。SDS PAGE电泳和分析结果表明添加重组cystatin可使鱼糜肌球蛋白具缓和内源性蛋白酶降解作用,具有明显的保护作用。     

罗非鱼 MC4R 基因克隆及与其生长相关的 SNPs 位点

黑素皮质素受体-4(Melanocortin receptor-4,MC4R)是5种已发现的黑素皮质素受体家族成员之一,属于跨膜G-蛋白耦联受体超级家族,对于调节动物的采食量、体质量及能最稳态有着重要的作用.本研究采用基因组步移技术获得了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)MC4R基因组DNA序列.该基因全长2547 hp,其中5'侧翼序列长为1481 bp,3'侧翼序列长为82 bp,编码区序列长为984 bp,只有1个外显子.采用PCR产物直接测序法、PCR-RFL和CRS-PCR技术对尼罗罗非鱼MC4R基因启动子和外显子区域进行了SNPs位点的检测和分犁,结果共检测到5个SNPs位点(-G1000C、-T974A、C276T、C561T和C708T),其中外显子上的3个SNPs位点均为同义突变.利用一般线性模型分析5个SNPs位点与尼罗罗非鱼生长性状的关系,结果表明,5个SNPs位点不同基因型之间体质量均值差异最大值分别为9.5%、23.2%、14.4%、18.6%和13.5%,没有达到显著水平(P＞0.05).将5个SNPs位点不同基因型组合成7种双倍型(去掉频率小于3%的组合),关联分析表明,在体质量和体长这2个主要生长性状方面,双倍型D4与D1、D3、D6存在显著性差异(P＜0.05),双倍型D2与D3、D6也存在显著性差异(P＜0.05).因而可以考虑将MC4R基因作为影响罗非鱼体质量等生长性状的候选基因,应用于罗非鱼分子标记辅助育种.     

草鱼GSTR基因外显子1、外显子2的SNPs筛选及其与生长性状的关联分析

根据草鱼EST数据库中的rho型谷胱甘肽硫转移酶基因cDNA序列设计引物,扩增预计存在的SNP位点.采用PCR产物测序法和PCR-RFLP法,在珠江水系草鱼养殖群体中筛选到2个SNP位点,分别位于外显子1和外显子2上,为C-T突变,且属于同义突变,统计了多态位点在群体中的分布:C十129T位点CC型占0.69％,TC型...     

红色荧光蛋白基因在转基因唐鱼中遗传和表达的稳定性分析

为了评估转红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因唐鱼新品系的稳定性,研究了RFP基因在不同世代转基因唐鱼中的遗传和表达情况。荧光显微镜下观察显示,RFP基因在F6和F10代所检测的组织器官中均有表达,并且两个世代间相同组织部位的表达水平相似。F6和F10代个体分别配对繁殖实验表明,RFP基因在转基因唐鱼后代中的遗传仍然符合孟德尔分离规律,而且培育出的转基因个体表型特征无显著差异。利用PCR技术在F2、F6和F10代转基因唐鱼基因组中扩增外源性肌球蛋白轻链2启动子、RFP基因编码区和整合位点上下游侧翼区域(片段总长度为4 883 bp),测序结果显示,3个世代间的外源基因序列完全相同,没有发生碱基缺失或突变等现象。研究表明,红色荧光蛋白基因在转基因唐鱼传代培育过程中保持了稳定的遗传和表达。     

草鱼胰岛素样生长因子_基因克隆及序列分析

采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从草鱼肝脏的总ＲＮＡ中扩增出胰岛素样生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）基因序列,定向克隆至质粒pUC18,测宇了该基因序列,推导期编码的蛋白序列,克隆的cDNA序列编码包括Ｂ,Ｃ,Ａ,Ｄ和Ｅ五个区域的１７个氨基酸,与鲤ＩＧＦ－Ｉ成熟肽比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为９３．８％和９７．１％,E区域分析结果表明,所克隆的草鱼ＩＧＦ－Ｉ序列属于ＩＧＦ－ＩＥa-2亚型。