猪传染性胸膜肺炎放线杆菌"菌影"的制备

本试验通过PCR扩增噬菌体PhiX174 的裂解基因E,将该基因连接到含有入PL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220 栽体中,从而使裂解基因E和启动阻遏系统入PL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建重组质粒pBV-E.再将含有E基因的裂解盒插入到App-E.coli穿梭载体pGZRS-18中,构建胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒.采用电击穿孔法将其转入胸膜肺炎放线杆菌中,含有打孔质粒的胸膜肺炎放线杆菌在28℃条件下生长到对数生长期,升温42℃诱导E基因的表达,制备了胸膜肺炎放线杆菌菌影.电镜观察菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外.本试验为进一步研究菌影这一新型菌苗及佐剂奠定了基础.     

牛分枝杆菌Spoligotyping和VNTR—MIRU的基因分型研究

为了探讨间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)和数目可变串联重复序列·结核分枝杆菌散在分布重复单元(VNTR-MIRU)基因分型法用于国内牛分枝杆菌的基因分型研究,初步了解我国牛分枝杆茵基因型种类、分布以及2种方法在我国应用的可行性.本研究收集东北、西北、华北、华南4个地区分离的10株牛分枝杆菌分离株,分别采用Spoligotyping和VNTR-MIRU对这些分离株进行基因分型,比较两种方法的分型效果,评价其在牛分枝杆茵基因分型中的应用.结果表明,使用Spoligotyping方法,10株牛分枝杆菌呈现出4种基因型,使用VNTR-MIRU方法,10株分离株也呈现4种基因型;当两种方法联合使用时,可以分为5种基因型,其中的2个茵株具有独特的基因型,显示来自不同地区的牛分枝杆菌存在主要的流行型为BCG家族.将Spoligotyping和VNTR-MIRU联合使用,可有效提高牛结核病的分子流行病学调查和病原学的监测效果.     

胎儿弯杆菌病TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立胎儿弯杆菌(C.fetus)定量检测方法,本研究根据C.fetus毒力因子表面蛋白(SapA)基因序列设计引物和一条特异的TaqMan水解探针,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测C.fetus的TaqMan荧光定量PCR方法.对该方法的特异性与敏感性研究,结果显示,该方法检测C.fetus结果均为阳性,而非C.fetus均为阴性;对带有SapA基因的阳性质粒的检测敏感性为10~8拷贝～10~2拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可敏感地检测到模板中13个拷贝的细菌DNA,其灵敏度是常规PCR方法的100倍.该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点.该方法为C.fetus快速检测试剂盒的研制打下了良好的基础.     

禽致病性大肠杆菌生物被膜的形成及其影响因素

为确定影响细菌生物被膜(BF)的形成条件,本研究采用BF体外定性观察和定量粘附性检测两种方法对1株野生禽致病性大肠杆菌(E.coli)在不同环境(培养时间、培养基类型、引导载体类型、营养条件)下产生BF的差异进行了研究。结果显示野生禽致病性E.coli其宿主体外BF最适形成条件是培养时间为48h,培养基为5%TSB、引导载体为平底96孔聚苯乙烯微孔板(美国Corning Costar)。其生长周期为8h时开始起始粘附、24h形成若干微菌落、36h微菌落粘连、48h形成完整的BF、72h细菌脱落开始下一轮的BF生长。糖分和适量的无机盐都可以在一定程度上促进BF的形成和被膜内细菌的粘附性提高。该研究表明禽致病性E.coliBF的形成周期,并为抑制其形成提供了实验依据。     

利用Red重组系统敲除大肠杆菌菌株ClpP基因方法的研究

为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒pCP20去除氯霉素抗性基因。结果表明:成功敲除大肠杆菌菌株ClpP基因。     

胎儿弯杆菌表面蛋白(SapA)基因的分段表达及其免疫原性分析

应用PCR方法扩增出胎儿弯杆菌表面蛋白基因（SapA）的2个基因片段SapA-N（1398bp）和sapA—C（1422bp）,采用DNA重组技术,将2个基因片段分别连接于表达载体pET32a（＋）,并在大肠杆菌中诱导表达（rSapA—N和rSapA—C）,用金属鳌合层析的方法纯化蛋白。以Western blot检测重组蛋白的免疫学活性,ELISA试验分析2种蛋白用于胎儿弯杆菌病血清学诊断的可能性。结果表明,以可溶形式表达的2部分蛋白分子量大小约66ku,与预期大小相符。纯化的蛋白均具有良好的免疫学活性,但蛋白rSapA-N比蛋白rSapA-C的免疫学活性高,rSapA-N具有良好的胎儿弯杆菌病血清学诊断的应用价值。     

哈尔滨市鲜肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解哈尔滨市单核细胞增生性李斯特茵(Lm)的污染状况及耐药状况.在哈尔滨市市场随机采集158份鲜肉样品,采用显色培养基分离,API试剂条和PCR鉴定等方法对样品中的Lm进行分离鉴定,并通过Kirby-Barer法测定分离菌株对24种抗生素的耐药性.结果从鲜肉中共分离到Lm 23株,检出率为14.56%,其中鲜猪肉检出率最高,达20.00%(14/70);23株分离菌株中耐药菌株为22株,耐药率高达95.65%.这表明哈尔滨市鲜肉中存在一定程度的Lm污染,并且分离菌株存在较严重的耐药现象.应加强控制动物饲料亚治疗抗生素的使用并严格遵守休药期,防止耐药菌株产生进而控制食源性疾病的发生.     

牛结核病病原生态学和流行病学研究

牛结核病是严重危害牛和多种动物的人畜共患病,作者将从牛结核病的病原分类、动物感染谱、传播途径、地区分布和流行情况以及影响疾病的流行因素等方面进行综述,旨在为牛结核病的研究和防制提供参考.     

胎儿弯杆菌表面蛋白SapA抗原单克隆抗体的制备

用原核表达的重组胎儿弯杆菌毒力因子表面蛋白(rSapA-N)免疫小鼠,采用细胞融合技术,共获得2株抗rSapA-N的单克隆抗体(MAb),经Ⅰg亚类鉴定,均为ⅠgG1,轻链为K链;Western blot证实这2株MAb均能与rSapA-N发生特异性反应,而与其它蛋白则不发生反应;以这2株MAb的杂交瘤细胞制备腹水,效价达到1:100 000和1:60 000.本研究制备的MAb,为研究和检测胎儿弯杆菌提供了一种重要的手段.     

检测牛结核抗体新型ELISA方法的建立及应用

利用分子克隆和Splicing by overlapping extension(SOE)技术,表达了重组蛋白rM70-83-E6,Western blot分析rM70-83-E6具有很好的特异性。以蛋白rM70-83-E6作为诊断抗原建立了间接ELISA方法,ELISA诊断方法的判定标准,即S/P≥0.5为阳性,S/P<0.4为阴性,0.5>S/P≥0.4为可疑。ELISA方法的特异性为96.0%、敏感性为69.4%。对67份PPD皮试阳性和50份PPD皮试阴性(117份)血清样品进行了检测,并与PPD皮试比较。67份PPD皮试阳性血清样品中有46份为ELISA检测阳性,阳性符合率为68.7%,50份PPD皮试阴性牛血清都为阴性,阴性符合率为100%,本ELISA方法与PPD皮试诊断方法总复合率为82.1%。研究表明,ELISA方法具有很好的开发和应用前景。