牛传染性鼻气管炎病gB蛋白的截短表达及间接ELISA方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的间接ELISA方法,本研究根据Gen Bank登录的IBRV全基因组序列,设计引物扩增糖蛋白B(g B)基因编码第190~524氨基酸残基(aa)的基因,构建重组质粒p ET-g B进行原核表达。SDS-PAGE结果显示目的蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,大小约为40 ku。Western blot鉴定表明目的蛋白具有良好的反应原性。以纯化的g B蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法,该方法敏感性好,特异性强,与其他病原血清无交叉反应,其组内组间变异系数均低于11%。与IDEXX公司的g B-ELISA试剂盒进行对比,阳性符合率为84.28%,阴性符合率为85.71%。采用本研究建立的方法对黑龙江省10个农场的血清样品进行了IBR的流行性调查,阳性率最高为65.52%,最低为5.56%,平均阳性率为18.01%。本研究建立的ELISA方法为进出口检疫和该病防制工作提供一种可选方法。     

Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白在毕赤酵母中共表达及免疫效果评价

为研究Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白在毕赤酵母中共表达及其免疫原性,本研究基于酵母细胞内表达载体pPICZA,利用独立编码三个衣壳蛋白表达盒构建质粒pPICZA-vp031,重组质粒经BglⅡ线性化后进行电转化,获得重组有三个独立表达盒重组酵母菌。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明衣壳蛋白均得到正确表达且具有良好抗原性。重组酵母菌经口服免疫小鼠后,机体能够产生血清特异性IgG抗体和黏膜sIgA抗体,淋巴细胞增殖结果显示免疫小鼠淋巴细胞特异性增殖指数显著高于灭活疫苗组,细胞因子检测结果显示经特异性抗原刺激免疫小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IL-10与灭活疫苗组无显著差异,显著高于PBS对照组,表明重组菌能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答。本研究为口蹄疫基因工程疫苗研制奠定基础。     

吴茱萸中吴茱萸次碱提取工艺及响应面分析法的优化

通过响应面分析法对吴茱萸中吴茱萸次碱的提取工艺进行优化,利用响应面试验设计乙醇体积分数、提取时间、原料目数、溶剂倍数4因素对吴茱萸次碱提取率的影响.结果表明,乙醇体积分数是主要--的影响因子.吴茱萸次碱的最佳提取条件是原料目数为40、提取时间为3.0 h、溶剂倍数为31、乙醇体积分数为72%,吴茱萸次碱的最大提取率为8.90mg·g-1.     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T—HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒（AIV）HA1基因，并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A，将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1，与线性化杆状病毒DNA（Bac—N—BlueDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3次蚀斑纯化，得到重组杆状病毒rpBlue-HisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示，HA1在昆虫细胞中得到表达，且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明，重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明，重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测

将口蹄疫病毒VP2基因连接到原核表达载体pPROEX^TM HTb上，获得重组质粒pPR-VP2。将此质粒转化感受态菌DH5α中，经终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导，1h～6h依次收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，在4h后表达量可达到高峰。经过软件分析，表达产物占总菌体蛋白的23．1％，大小为33Ku左右。根据Ni-NTA纯化系统说明操作，获得较纯的VP2融合蛋白。以牛抗O型口蹄疫病毒血清为第一抗体，通过Western blot和Dot ELISA鉴定，纯化后的VP2融合蛋白可以与牛抗O型口蹄疫病毒血清发生特异性反应。     

应用GPV VP3基因重组原核表达产物建立检测抗体的ELISA方法研究

利用鹅细小病毒（GPV）VP3基因的原核表达蛋白作为包被抗原建立了检测GPV抗体的间接ELISA及Dot-ELISA方法。经确定两种方法的抗原包被浓度为125μg／mL，其中间接-ELISA 100μL／孔、Dot-ELISA 5μL／点。间接-ELISA中HRP标记的兔抗鹅IgG的工作浓度是1：200，检测血清的最适稀释度是1：400，阳性判定标准为OD492≥0．20，且P／N≥2．0。用此方法检测弱毒疫苗免疫血清，其抗体滴度在1：400～1：51200。Dot-ELISA的结果与间接-ELISA的结果一致。     

我国猪布鲁氏菌病流行现状及研究进展

布氏杆菌是重要的人兽共患病病原体。该病在世界各国流行广泛,严重危害人类健康和畜牧业发展,还是美国军方成功研发的第1个细菌战武器。布氏杆菌分为猪型,流产型,马耳他型,犬型,绵羊型,沙林鼠型和最近新发现的水生动物型。猪布氏杆菌在全世界多数国家的野猪和家猪中都有发生,对人也表现出高度易感性,危害也较为严重。     

口蹄疫病毒全长cDNA感染性克隆的研究进展

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一种给畜牧业带来严重经济损失的传染病,FMDV是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员.其RNA本身的结构特点和不稳定性增加了对其分子结构及功能研究的难度.     

减蛋综合征病毒五邻体重组蛋白的原核表达及抗原性鉴定

根据减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127株的全基因序列(GenBank序列号AC000004)设计了1对引物,采用PCR扩增出五邻体(Penton)完整基因,将其连接到克隆载体pMD18-T,经过鉴定后测序。序列分析表明,所获得的DNA片段核苷酸序列和GenBank中AV-l27株的五邻体比较有9个碱基突变,但利用DNAstar分析,两者的氨基酸完全一致。然后酶切胶回收后将目的片段连接到质粒表达载体pET-30a(+),获得的阳性克隆命名为pET-30a-Penton。将pET-30a-Penton转化E.coli Rosetta,经37℃、1.0 mmol·L-1 IPTG诱导表达5 h,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,结果显示目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为54.0 ku。Western Blot试验结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。