牛IFN-α基因高效表达及纯化的研究

基于对RNA二级结构的预测和密码子偏性计算,通过计算机辅助软件进行牛IFN-α基因优化,经人工合成优化后的基因与pWL表达载体连接后诱导表达,并对表达条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,其产物分子量约为17ku,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的33％,表达产物以包涵体形式存在。经过包涵体溶解、初步复性后利用CM Sepharose Fast Flow离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,采用梯度法进行牛α-干扰素包涵体蛋白质的纯化复性。结果表明,梯度离子交换层析法能有效地复性牛α-干扰素包涵体,复性后的重组牛α-干扰素的纯度达95％,通过离子交换层析柱纯化和复性后,重组牛α-干扰素在MDBK/VSV细胞系上的抗病毒活性为5．56×10^6 u／mg。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的原核表达及其产物的活性检测

利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增出FMDV3ABC基因，将其克隆到pMD18-T载体。经BamHⅠ和SaⅡ酶消化后，克隆到表达载体pGEX-6p-1上，构建重组质粒pGEX-3ABC。将该重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21（DE3）pLysS，经终浓度1mmol／L的IPTG诱导，获得约70ku的融合蛋白GST-3ABC。Western-blotting结果显示，表达的融合蛋白GST-3ABC可以与感染FMDV的牛血清发生免疫反应。以纯化的GsT-3ABC蛋白为抗原的间接ELISA检测结果与以VP2蛋白为抗原的间接ELISA检测结果相比较，表明，融合蛋白GST-3ABC可以用于鉴别感染FMDV和疫苗免疫的牛血清。     

α疱疹病毒gH与gL蛋白的研究进展

疱疹病毒种类繁多,可感染哺乳类、鸟类、两栖类和无脊椎动物,引起多种疾病。也有一些病毒可以在宿主体内终生潜伏。迄今至少已鉴定100种疱疹病毒,其中19种已完成全基因组测序,包括马疱疹病毒1、2及4型,牛鼻气管炎病毒等。疱疹病毒分为4个亚科,即α疱疹病毒亚科、β疱疹病毒亚科、     

A型产气荚膜梭菌小鼠感染模型的建立

近年来,我国许多牛场暴发产气荚膜梭菌病,同时产气荚膜梭菌病疫苗及其致病机制的研究不断深入.本试验以牛源A型产气荚膜梭菌强毒株C987株为基础,通过灌胃或皮下注射方式接种小鼠,记录其发病和死亡情况,并剖检观察小鼠内脏各器官病变及组织学变化,建立小鼠感染模型.结果表明,灌胃和皮下注射接种方式,A型产气荚膜梭菌对小鼠的半数致死量分别为4.35×109 CFU和8.0×106 CFU.感染小鼠腹部明显膨大,剖检内脏器官均出现明显病变,组织化学染色显示内脏器官大多出现淋巴细胞浸润及不同组织学变化.皮下注射方式在接种细菌数量、试验平行性、小鼠死亡率上均优于灌胃接种方式,因此皮下注射接种方式更适合作为A型产气荚膜梭菌小鼠感染模型的接种途径.本试验为牛A型产气荚膜梭菌疫苗的评价及其致病机制的研究提供了一种合适的动物模型.     

多重PCR方法快速检测3种消化道病原菌

为建立一种检测和鉴别诊断动物奇异变形杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌感染的方法,本研究针对奇异变形杆菌脲酶调节子基因(ureR)、沙门氏菌侵袭蛋白A基因(invA)及产气荚膜梭菌α毒素基因(α-toxin)序列设计引物,建立一种同时检测3种细菌的多重PCR方法,并对扩增体系和条件进行了优化,建立的多重PCR检测方法特异性良好,对3种目的菌最低检出限均在105cfu/mL以上。初步应用该方法检测3种细菌单独人工感染小鼠的病变组织和人工模拟细菌混合感染的临床样品,结果证明该方法可以用于临床样本检测。     

FPV在鹅胚上的驯化及部分TK基因的克隆与序列分析

通过将禽痘病毒接种15日龄鹅胚的绒毛尿囊膜的方法对其进行驯化,使其适应鹅胚,并出现典型病变;再以驯化第9代的病毒接种16日龄雏鹅,通过PCR的方法在接种后10d的鹅血液中检出病毒。根据已发表的禽痘病毒TK基因序列设计1对引物,采用PCR技术扩增出与预期设计的600bp大小相符的TK基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体,经酶切鉴定筛选出阳性克隆,进行序列测定和分析。序列分析表明:所扩增的TK基因的核苷酸长度为552bp,,共编码183个氨基酸。同源性分析表明:经鹅胚驯化的FPVTK基因片段与已发表的282E4株FPVTK基因比较核苷酸序列同源性为99.82%,氨基酸序列同源性为99.45%。     

鸭肠炎病毒us2基因转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增得到us2全基因(包含s3、us3部分基因),将扩增产物克隆入pMD18-T载体,EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切连入pUC19载体,获得质粒pUC-us2.将完整的EGFP表达盒插入us2基因内BamH Ⅰ位点,得到转移载体质粒pUC-us2-EGFP.脂质体法将转移载体质粒pUC-us2-EGFP转染DEF细胞,观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得表达.     

牛口蹄疫病毒VP2结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

为建立牛口蹄疫(FMD)抗体的检测方法,本研究将口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因,通过pPROEXTM HTb表达载体在大肠杆菌DH5α中表达,获得大小为35ku的重组VP2蛋白(rVP2),western blot证实rVP2可与FMDV5种血清型的牛阳性血清发生特异性反应。以纯化复性的rVP2为抗原建立了FMDVrVP2间接ELISA方法。重复性试验证实批内、批间变异系数均小于10%。特异性交叉试验表明,该抗原不与常见的其他7种牛病阳性血清发生交叉反应。检测非免疫无口蹄疫国家牛阴性血清的特异性为100%;检测感染血清敏感性为97.3%;检测O-AsiaⅠ的二价苗免疫牛血清,与4种商品化试剂盒比较,其符合率分别为69.0%、95.0%、90.4%和86.8%。实验结果表明建立的ELISA方法可以用于口蹄疫感染和免疫抗体检测。     

茨城病毒VP7蛋白基因的克隆表达及间接ELISA方法的建立

采用RT-PCR方法扩增出了茨城病毒（IBAV）No．2株编码VP7蛋白的S7全长基因，并克隆入原核表达载体pET-28a（＋）中，在E．coli BI.21中表达。经Western-blot检测，表达的重组VP7蛋白具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，初步建立了检测IBAV血清抗体的间接ELISA方法。     

胶体金免疫层析技术及其在兽医诊断上的应用

胶体金技术是继三大标记技术后对标记技术的又一重大贡献,1962年Feldherr CM等第1次介绍了胶体金可作为一种电子显微镜水平的示踪标记物。1971年FaulkWP和TaylorGM首次用胶体金标记技术研究沙门菌细胞抗原成分,将胶体金与抗原结合,应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。30多年来,胶体金技术得到不断的发展和成熟,引进到免疫诊断领域,在人类医学、农牧业、环保及食品安全领域得到了广泛的应用。近年来,胶体金快速诊断技术被引入生物传感器中的应用研究逐渐增多,已有许多致力于信号放大免疫传感器的研制报道。文章综述了胶体金技术、胶体金免疫层析技术及其在兽医诊断上的应用。