种鹅免疫小鹅瘟疫苗抗体消长规律的研究

通过应用小鹅瘟油乳剂疫苗和成鹅弱毒疫苗联合免疫种鹅(设为试验A组)并采用成鹅弱毒疫苗进行二次免疫种鹅的方法(设为试验B组)建立了种鹅小鹅瘟抗体消长规律的监测试验。试验结果表明:B组的免疫抗体效价整体高于A组免疫抗体效价,并且通过对后代雏鹅的攻毒试验表明B组保护力强于A组。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB单克隆抗体的制备及其对应表位区分析

为鉴定口蹄疫病毒(FMDV)的非结构蛋白3AB的抗原表位,本研究以原核表达并纯化的FMDV 3AB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,获得6株能够稳定分泌抗3AB蛋白特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞.这6株MAbs亚类鉴定均为IgG1型,轻链均为K链.间接免疫荧光试验结果表明,这6株MAbs均能够识别FMDV 3AB蛋白.采用制备的MAb对分段表达的3AB蛋白进行western blot分析,结合位点分别位于3AB的第aa 55～aa 70、aa 64～aa 79、aa130～aa145区段.该结果为进一步探索3AB蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础.     

鸭、鹅卵黄免疫球蛋白提取的比较研究

以氯仿抽提法提纯鸭、鹅卵黄免疫球蛋白,免疫电泳分析纯度,SDS-PAGE分析成分和含量并将二者进行比较,以琼脂扩散测定二者间及其与鸡IgY、猪IgG、牛IgG、鼠IgG间抗原性交叉情况。结果表明:鸭、鹅卵黄免疫球蛋白均由IgY和IgY(△Fc)组成,二者IgY和IgY(△Fc)的含量比分别为3∶1和12∶1;鸭、鹅卵黄免疫球蛋白间较二者与鸡IgY间抗原性交叉低。     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒（GPV）的检测抗原，利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VPl与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP（1-3），分别转染sf9细胞，得到重组病毒，分别表达出了54ku的NS2融合蛋白和24ku的VP（1-3）融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实，表达产物具有特异性；间接免疫荧光试验证实，重组蛋白在细胞中获得了表达。     

Asial型口蹄疫病毒VP2蛋白B细胞线性表位的鉴定

为了对Asial型口蹄疫病毒VP2蛋白进行抗原表位作图,设计了7个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个VP2蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达.用Asial型口蹄疫感染血清对7个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出VP2蛋白B细胞线性抗原表位位于氨基末端的第1-44氨基酸区域,并且证实O型、A型、C型口蹄疫标准血清和感染SAT2型口蹄疫康复期的牛血清也能识别融合蛋白F1(1-44 aa).在此基础上,针对F1(1-44 aa)短肽,设计了6个相互重叠5个氨基酸的短肽片段,进一步鉴定出了VP2蛋白B细胞线性表位位于氨基末端的第6-15氨基酸区域.     

牛病毒性腹泻诊断技术

牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease/mucosal disease,BVD/MD）,简称牛病毒性腹泻（BVD）或牛黏膜病（BMD）,是以牛发热、黏膜糜烂和溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病[1].病原是牛腹泻病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVDV）,属于黄病毒科（Flaviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的成员.根据它在细胞培养物上的特性,BVDV分为两种生物型：一种为致细胞病变型（CP型）,能引起细胞形成空泡,核固缩、溶解和死亡等;另一种为非致细胞病变型（NCP型）,此型病毒在细胞中复制不引起细胞病变.两种生物型除了与宿主细胞作用不同外,血清型相同.1946年Olafson等首次报道病毒性腹泻病.1980年,李佑民首先证明我国也有本病存在.自20世纪80年代以来,我国已有15个省、市、自治区查出该病,感染动物包括牛、羊、猪、骆驼、鹿等.王新平等对内蒙古、吉林、宁夏等不同地区的牛、羊、鹿群进行了病原学调查,结果发现牛病毒性腹泻病毒的感染率分别为16.5%～89.0%、14.6%～83.3%、19.6%～44.4%,表明本病在国内某些地区存在严重感染。     

鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测

为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。     

牛乳头瘤病毒2型L1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

试验旨在表达牛乳头瘤病毒(BPV)的L1衣壳蛋白,并制备其多克隆抗体。对疑似牛乳头状瘤的病料进行病理组织学检查,采用L1基因简并引物FAP59/FAP64进行扩增,然后设计特异性引物,将衣壳蛋白L1基因亚克隆至pET-30a(+)表达载体中,构建重组原核表达载体pET30a-BPV2-L1,在E.coli Rosetta~(TM)(DE3) pLysS宿主菌中表达重组蛋白rBPV2-L1,并以纯化的rBPV2-L1蛋白为免疫原制备兔抗BPV2-L1蛋白多克隆抗体,随后间接ELISA检测其效价,并进行间接免疫荧光试验分析。病理组织切片观察结果显示,病变部分表皮细胞增生、角质过度并出现细胞挖空等BPV感染的组织病变情况;序列分析确定BPV分离株的基因型为2型,L1基因编码区长1 494 bp,可编码一个含有497个氨基酸的衣壳蛋白,蛋白分子质量为55.5 ku;与各型BPV的L1氨基酸序列系统进化树分析结果显示,其与BPV2-SW01(GenBank登录号:KC878306.1)、BPV2(GenBank登录号:KX113620.1)处于同一遗传进化分支,且属于Delta属成员;诱导表达的rBPV2-L1蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中;间接ELISA法检测多克隆抗体效价高达1∶163 840,间接免疫荧光分析表明,兔抗BPV2-L1多克隆抗体能与瞬时表达的BPV2-L1蛋白发生特异性反应。以上结果证实,本研究成功克隆、表达了BPV2 L1基因,且重组蛋白rBPV2-L1具有较好的免疫原性,所制备的BPV2-L1蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,为进一步研究BPV2亚单位疫苗奠定基础。