鹅细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达及纯化

将鹅细小病毒 (GPV) VP2基因插入原核表达载体 p PROEX- HTb,获得重组表达质粒 p PROEX- HTb- VP2。将其转化大肠杆菌 DH5α,用 IPTG诱导表达 ,表达菌体蛋白中可产生与预期大小相符的约 72 0 0 0的蛋白。以光密度扫描对该表达产物进行定量分析 ,表达产物约占菌体总蛋白的 14 %。经 His- tag金属螯合层析纯化 ,获得纯度较高的 6 His- VP2融合蛋白。 Western- blot结果表明 ,所得蛋白与鹅抗 GPV高免血清有较好的免疫反应性 ,说明在 VP2的 N端融合 6个组氨酸不影响其与特异抗体结合的活性。     

犊牛腹泻粪便中类冠状病毒

犊牛腹泻病是我省一些牛场普遍存在的一种疾病,它严重影响我省养牛业的发展。引起犊牛腹泻的病原体有细菌和病毒。一般认为引起犊牛腹泻的病毒有轮状病毒、细小病毒和冠状病毒。最近在我们研究病毒性犊牛腹泻病病原体的过程中,发现在犊牛腹泻粪便中有类冠状病毒,并发现此病毒可引起犊牛腹泻和死亡。现将研究结果报告如下。     

表达鹅副粘病毒F基因的禽痘重组病毒构建

本研究利用基因重组技术构建含有鹅副粘病毒(GPMV)主要保护性抗原F基因和LacZ报告基因的重组禽痘病毒转移载体;利用脂质体介导的方法将所构建的转移载体转染禽痘病毒(FPV)017株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白筛选获得重组病毒;Western blot和间接免疫荧光试验结果显示重组禽痘病毒中F基因在CEF中获得表达,并且表达产物具有良好的反应原性;本研究为进一步的研究重组禽痘病毒的免疫保护性奠定了基础.     

牛IgG轻链的分离纯化及其多克隆抗血清的制备

实验应用凝胶过滤和盐析等方法直接从牛初乳中分离纯化IgG,并应用化学方法断裂回收IgG轻链。分离纯化获得分子量约27.66 ku的IgG轻链蛋白溶液,蛋白质含量为0.105 mg.L-1,浓缩后免疫家兔,获得抗轻链抗血清,效价>11∶6,免疫双扩散和免疫电泳均为特异性条带,表明得到了纯化的IgG轻链及其特异性抗血清。     

鸭非特异性细胞免疫发生的研究

实验利用鸭全血中单核细胞,粒细胞,血栓细胞及自然杀伤细胞对酵母细胞非特异性细胞毒性作用,检测了１５日龄鸭胚到１１２日龄鸭非特异性细胞免疫的发生。实验结果表明,鸭胚孵出前１周的２２日龄到孵出后３日龄是鸭非特异性细胞免疫的发生期;３￣１１２日龄鸭在正常的生理状态下非特异性细胞免疫水平没有明显的变化。     

猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫研究

将昆明鼠随机分为A,B,C,D4组,各组分别采用含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7,含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组真核表达质粒pcDNA-N,pcD-NA-VP7和pcDNA-N、真核表达载体pcDNA3.1(+),肌肉注射3次,每次间隔2周。首次注射前后定期采血,检测血清抗体和外周血淋巴细胞中CD4+,CD8+T细胞数量的变化。A,C组小鼠血清在首免后第14天即可检出针对RVVP7的阳性抗体(P/N≥2.0)。B组小鼠血清在首免后第39天检出针对TGEVN蛋白的阳性抗体(P/N≥2.0)。A,B,C组小鼠在首免后外周血CD4+、CD8+T细胞数量与D组小鼠相比,在不同时间有显著差异(P<0.05),并明显高于D组小鼠。说明猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫后能诱发机体免疫反应。     

北京鸭胸腺和法氏囊中淋巴细胞膜蛋白成分的初步比较

北京鸭屠宰后,取其胸腺、法氏囊,经淋巴细胞分层液分离后,再经尼龙棉柱得到胸腺细胞(T-C)和法氏囊细胞(B-C),其中一部分用以提取细胞膜蛋白,并用SDS-PAGE电泳进行鉴定分析.用完整细胞和提取的膜蛋白分别作为包被抗原,兔抗鸭胸腺淋巴细胞多克隆抗体(RADTS)和兔抗鸭免疫球蛋白(Ig)轻链多克隆抗体(RADLCS)作为第一抗体进行间接ELISA试验,对所提膜蛋白成分加以区分、比较.结果表明:北京鸭T-C、B-C膜上存在多种共同的膜蛋白成分,并且胸腺细胞上有类似于Ig轻链的成分,但其数量低于法氏囊细胞上的数量.     

Asia1型FMDV非结构蛋白3A基因的克隆、表达与抗原性鉴定

为了研究Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A的抗原性,试验对Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3A基因进行扩增、亚克隆及测序,将3A克隆至表达载体pET-32a(+)中,选取阳性克隆转化Rosetta(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导表达和纯化3A蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-blot分析。结果表明:在大肠杆菌中成功地表达了3A蛋白,表达的目的蛋白能与Asia1型FMDV阳性血清发生特异性反应。说明非结构蛋白3A具有较好的抗原活性。     

牛腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素重组亚单位疫苗诱导小鼠免疫保护效果的观察

以大肠杆菌表达系统表达并纯化的牛源坏死杆菌H05菌株5个截短的重组白细胞毒素蛋白PL1（1aa～174aa）、PL2（311aa～644aa）、1ktA3（1319aa～2026aa）、PL4（1960aa～2287aa）和PL5（3077aa～3241aa）为抗原分别免疫昆明系小白鼠,同时将灭活的天然坏死杆菌白细胞毒素和PBS作为免疫对照。ELISA结果显示,经4次免疫后5个重组蛋白和天然白细胞毒素均能介导小鼠产生抗白细胞毒素蛋白的特异性抗体,抗体效价分别为1：6400、1：12800、1：6400、1：12800、1：3200和1：800。免疫鼠活菌攻击观察结果和免疫鼠肝脏组织学变化结果一致证明,PL1、PL2、1ktA3、PL4、PL5重组蛋白和天然白细胞毒素对小鼠均具有保护作用,5个重组蛋白的免疫保护作用均优于天然白细胞毒素,在5个重组蛋白中PL1、1ktA3和PL4对鼠的免疫保护效果最好。     

鹅细小病毒VP3蛋白B细胞线性表位的精确定位

本试验旨在利用获得的4株抗鹅细小病毒(GPV)VP3的单克隆抗体,进一步对GPV VP3 B细胞线性抗原表位精确定位。根据笔者实验室已鉴定的线性抗原表位区结果,筛选出单抗所针对的优势抗原表位区。设计并合成互相重叠5 aa的10 aa短肽寡聚核酸片段,退火后,连入pET-32a载体,经转化鉴定,诱导表达后,获得相应的小片段融合蛋白,并利用单抗通过Western blot进行抗原性鉴定。同样方法进行短肽片段两端氨基酸的逐个缺失设计,进一步精确定位,结果鉴定出2个抗原表位,分别为430-435 aa和643-647 aa。