副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种快速、敏感、特异的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR,FQ-PCR)检测方法,根据Gen Bank登录的HPS 16S rRNA基因序列,设计1对特异性引物和1条特异性Taq Man-MGB探针,建立了HPS荧光定量PCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性以及重复性和稳定性进行了验证。结果显示:本研究建立的HPS FQ-PCR方法在10~1~10~6拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系,所得相关系数为0.998;检测灵敏度可达10拷贝/μL,是常规PCR的10倍;特异性好,对pGEM-T/HPS重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对4个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/HPS重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好。对30份临床疑似HPS感染的组织样品进行应用检测,检出19份阳性,比商品化的HPS FQ-PCR检测试剂盒及常规PCR方法的阳性检出率高。结果表明,本研究建立的HPS FQ-PCR方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的优点,可用于临床HPS感染猪的早期检测,对HPS的快速诊断、综合防控具有重要意义。     

犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R~2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。     

猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2嵌合表达质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应

为探讨猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2/猪白介素-2(PoIL-2)嵌合重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)在猪体内的免疫效果和免疫保护效果进而研制高效PCV2核酸疫苗,将35只10日龄健康仔猪平均分成7组分别以rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2重组表达质粒或PCV2ORF2基因原核表达的rCap蛋白进行免疫及免疫保护试验。共进行4次肌肉注射免疫,每次间隔2周;于第4次免疫后3周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2细胞强毒。分别于第4次免疫后和攻毒后不同时间通过检测免疫猪血清抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖活性、辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)亚群的百分含量、排毒率和病毒血症阳性维持时间等指标以评价其免疫和免疫保护效果。结果表明,各免疫组猪均产生了抗PCV2特异性ELISA免疫抗体,但rCap蛋白免疫组猪抗体水平较低;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著优于rpcDNA3.1/ORF2质粒;在rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒或rpcDNA3.1/ORF2质粒中添加rCap蛋白对重组质粒免疫及免疫保护效果无明显影响。因此,选取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒为下一步研制PCV2核酸疫苗的主要成分。     

麻鸭γ-干扰素基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR技术,直接从成年麻鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增出麻鸭γ-干扰素基因(duIFN-γ),并克隆、测序。测序结果表明,麻鸭IFN-γ全序列大小为515 bp,包含一个完整阅读框(495 bp),编码164个氨基酸残基,推导的氨基酸有3个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。麻鸭IFN-γ基因序列与AF087134、AF100929、AJ012254的序列完全一致,而与北京鸭(AY166850)核苷酸同源性为99.6%,有2个碱基差异,为非同义突变,氨基酸同源性为98.8%。麻鸭IFN-γ基因与鸡、火鸡和鹌鹑IFN-γ基因核苷酸序列同源性分别为77.2%、78.0%、78.8%,氨基酸序列同源性均67.1%,而与人、狒狒、猪、牛、绵羊、犬、猫IFN-γ核苷酸序列同源性为39.7%～42.1%,氨基酸序列同源性在28.0%～31.7%之间。     

乳浆大戟提取物的杀虫抑菌活性研究

生物农药开发前景广阔,乳浆大戟作为一种中草药,分布广、资源丰富,可利用其自身的毒性开发生物农药。以75%乙醇加热萃取法提取乳浆大戟中的活性成分,进行了杀虫抑菌生物活性试验,为乳浆大戟开发为新型生物农药提供科学依据。试验结果表明：提取物对果蝇及桃蚜具有良好的毒杀活性,提取物对果蝇的半致死量LC50为75.51 mg/mL,果蝇死亡率与提取物浓度呈正相关,对桃蚜毒性的半致死量LC50为9.35 mg/mL,当提取物浓度为50 mg/mL时对桃蚜的校正死亡率为85.59%;提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌均有一定的抑菌作用,其中对枯草芽孢杆菌抑制作用较强,最大抑菌圈直径为1.53 cm;25 mg/mL的提取物对玉米大斑病菌落扩展有明显抑制作用,抑菌率45.28%,对盆栽玉米苗大斑病的防治效果为36.63%。     

稳定和过渡工况下柴油机活塞顶面瞬态热负荷变化规律

发动机活塞热疲劳失效主要有稳定工况下周期性热冲击导致的高周疲劳失效和在冷启动、急加速、急减速等过渡工况下热冲击引起的低周疲劳失效两种形式。为探究柴油机活塞在不同工况下活塞的热负荷变化情况,该文以一款非道路用高压共轨柴油机为研究对象,基于活塞顶面瞬态温度试验测试结果,采用热-机解耦方法建立了稳定工况及冷启动、急加速和急减速等过渡工况下的活塞热负荷有限元仿真计算模型,分析了发动机在稳定工况、冷启动、急加速和急减速过程中活塞的热负荷变化规律。研究结果表明：稳定工况下活塞的热负荷波动现象仅出现在活塞顶面、火力岸和第一环槽位置,且热负荷波动幅值随着距离活塞表面深度的增加而逐渐减小,温度波动深度范围为3 mm;活塞周期性瞬态热应力波动主要发生在活塞顶面,其他区域波动较小,热应力波动深度范围为5 mm,最大热应力波动幅值出现在燃烧室喉口区域,达到32.3MPa。过渡工况下活塞的热负荷变化较大,其中：冷启动过程中活塞的热应力出现跳跃性急剧升高,随后又快速降低的现象,活塞热负荷的变化幅度较大,温度、热应力和热应变分别达到200 ℃、42 MPa和0.3 mm;急加速过程中活塞温度场、热应力和热变形都急剧升高,虽然活塞的温度和热应变的变化量相对较小,为140 ℃和0.12 mm,但活塞燃烧室喉口热应力变化幅值达到93 MPa,易造成活塞热疲劳失效,从而对活塞可靠性和耐久性产生较大影响;急减速过程出现活塞各测点先短暂升高、后缓慢小幅度降低、并在200 s后趋于稳定的现象,急减速过程中活塞的温度、热应力和热应变的变化幅度均较小,最大变化量分别在30 ℃、10 MPa和0.02 mm以内。研究结果可为高强化柴油机铝合金活塞设计提供参考。     

柴油机活塞热机耦合疲劳强度分析

以一款非道路高压共轨柴油机铝合金活塞为研究对象,采用硬度塞测温法试验测试了活塞在最大转矩工况及标定工况下表面19个特征点的温度值,并结合经验公式得出活塞表面的热边界条件;采用有限元的方法求得的活塞的温度场与活塞温度场试验吻合;在活塞温度场的基础上分析了活塞的热应力场及热机耦合应力场,得到了活塞的易失效点,为柴油机铝合金活塞抗疲劳设计提供了理论基础。     

硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库的构建与初步筛选

旨在构建硫代磷酸酯类杀虫剂单链抗体(ScFv)库,并对其进行初步筛选。采用RT-PCR法从牛血清蛋白(BSA)人工抗原免疫的Balb/C小鼠脾细胞中克隆出VH和VL基因,通过重叠延伸PCR方法将VH和VL基因拼接在一起,构建ScFv基因,与表达载体pCANTAB 5E连接后,在大肠杆菌中诱导表达。采用亲和富集法,经6轮淘筛后用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定其活性。得到滴度为2.2×106 pfu/mL噬菌体库,ELISA检测呈阳性。说明成功表达并筛选得到鼠源抗硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库。     

猪伪狂犬病病毒疑似感染人的实验室诊断及分析

为给人感染伪狂犬病病毒(PRV)来源分析及其感染机理研究提供相关信息，对一例疑似感染PRV患者的血清、脑脊液、拭子及其工作猪场的病猪血清、组织等样品进行病原学、血清学检测及病毒分离，对其工作猪场开展流行病学调查，并采集患者同事血清样品进行PRV抗体检测。结果显示：病人样品经数字PCR检测均为PRV核酸阳性；病人发病后5～90 d内的血清样品均为PRV gB抗体阳性，gE抗体发病后18 d转为阳性并一直持续到发病后90 d；病人同事均未表现临床症状，其血清样品PRV gB抗体阳性率为22.2%,gE抗体均为阴性；从病人工作猪场的病猪样品中分离到PRV，且样品经荧光定量PCR核酸检测及ELISA抗体检测均检出阳性；病人工作猪场为PRV阳性场，病人及PRV gB抗体阳性同事均有直接接触病猪史。结果表明，患者感染的PRV来自其工作猪场猪群的可能性较大，人感染后表现出和动物感染相似的抗体消长规律。PRV对公共卫生的影响及其感染机制需进一步关注和研究。