利用CRISPR/Cas9技术突变BnaMPK6基因降低甘蓝型油菜的耐盐性

甘蓝型油菜是我国一种重要的油料作物。MPK6是一种丝裂原活化蛋白激酶, MAPK级联途径可以被各种胁迫激活,进而调节植物对胁迫的响应,在植物响应非生物胁迫过程中发挥着重要的作用,但在甘蓝型油菜盐胁迫响应过程中的功能还尚不清楚。基因结构和蛋白序列分析表明,MAPK6在十字花科芸薹属植物种间分化相对保守,基因结构相似,蛋白之间均有相同的STKc＿TEY＿MAPK结构域,与胁迫和生长发育相关。为探究其功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术对BnaMPK6基因进行编辑,通过农杆菌介导的方法将BnaMPK6基因转入到甘蓝型油菜中,获得了BnaMPK6基因4个同源拷贝同时突变的材料:cr-bnampk6-13-1和cr-bnampk6-49-1。cr-bnampk6突变体表现出明显的盐敏感性:在100 mmol L^–1和150 mmol L^–1浓度的NaCl溶液处理下,功能缺失突变体长势明显缓慢,并且株高和鲜重显著低于野生型植株,但根长无明显差异。此外,在盐胁迫下,功能缺失突变体体内的活性氧和丙二醛含量的积累显著高于野生型对照,脯氨酸含量也明显高于野...     

甘蓝型油菜BnAPs基因家族成员全基因组鉴定及分析

天冬氨酸蛋白酶(AP)属于四大蛋白水解酶之一,在蛋白质加工、信号转导和胁迫反应中发挥着重要作用。甘蓝型油菜是我国重要的油料作物,利用蛋白质同源性分析,在甘蓝型油菜中鉴定出154个APs编码基因,分别编码典型、非典型和珠心类天冬氨酸蛋白酶。基因结构分析结果表明,多数BnAPs基因包含1～4个外显子,同一类型的天冬氨酸蛋白酶成员之间蛋白质基序(Motif)分布相似。共线性分析表明,甘蓝型油菜与白菜、甘蓝和拟南芥存在大量的同源基因,约89%的BnAPs基因来自于全基因组复制事件。转录水平检测结果表明,BnAPs基因家族成员在各个组织中均有表达,其中BnAP30.A05.1/A05.2/C05.1/C05.2、BnAP36.A04/C08、BnAP39.A06/C03在授粉后的柱头显著提高。BnAPs基因启动子区域顺式元件分析结果表明,逆境相关的顺式调控元件被显著富集;进一步利用RT-qPCR验证了这些富含逆境相关顺式调控元件的基因在逆境(ABA、NaCl或4℃)处理后的表达水平显著变化,推测这些BnAPs基因可能参与甘蓝型油菜对逆境的响应。进一步和拟南芥同源基因组织表达模式进行比较后发现,大...     

甘蓝型油菜萌发期耐盐碱性高效鉴定及抗性资源筛选

种子萌发期对盐碱胁迫最敏感，因而建立准确、简便、高效的种子萌发期耐盐碱鉴定评价体系对于筛选出优质耐盐碱油菜种质具有重要价值。本研究以166个甘蓝型油菜品种、骨干亲本和杂交组合等为试验材料，用穴盘、医用纱布、方形容器等组建了一套油菜水培萌发装置。依靠此系统，选取1.0%NaCl和0.10%Na₂CO₃模拟盐碱混合胁迫，对甘蓝型油菜种质萌发期抗性进行了鉴定与评价。研究结果显示，高盐碱胁迫抑制油菜种子萌发，且不同基因型种子材料萌发期耐盐碱性存在广泛的遗传变异性。进一步对油菜种子萌发后状态进行分级，可将所测定的166份油菜资源分为4个耐盐碱等级，其中，筛选获得11份抗性等级为3级的耐盐碱油菜资源，主要包括华油杂62、华油杂158、67棚20育11、67棚20育16等品种、骨干亲本和杂交组合。本研究为油菜耐盐碱遗传研究与育种改良提供了鉴定技术和种质资源。     

油菜细胞质雄性不育基因orf138、orf288的功能分析

为确定油菜ogu CMS不育基因orf138编码蛋白的毒性与雄性不育的关系以及hau CMS不育基因orf288的核心功能区域,对2个不育基因进行不同长度的截短,进行原核表达和拟南芥、油菜遗传转化。不育基因orf138截短研究结果显示,IPTG诱导后,转入含有跨膜螺旋的pET32a^1-138和pET32a^1-93的大肠杆菌生长受到了明显的抑制,而转入去掉跨膜螺旋的pET32a^45-138的大肠杆菌生长不受影响,表明ORF138的毒性区域位于包含跨膜螺旋的N端;遗传转化结果证实PS∶Rfp138^35-138和PS∶Rfp138^45-138均不能引起拟南芥和油菜雄性不育,说明N端的毒性区域是ORF138引起植物雄性不育所必需的。不育基因orf 288不同长度截短的超表达载体拟南芥转化结果显示,PS∶Rfp288^104-288、PS∶Rfp288^134-288和PS∶Rfp288^164-288的转基因阳性苗出现雄性不育...     

低温胁迫下甘蓝型冬油菜BnYUCCA8基因差异表达及内源生长素含量变化

甘蓝型冬油菜下胚轴长短与其抗寒性强弱呈负相关关系。为研究下胚轴伸长相关的BnYUCCA8基因对低温胁迫的响应，采用同源克隆技术从甘蓝型冬油菜中克隆了BnYUCCA8基因，其CDS全长1 281 bp,编码426个氨基酸。生物信息学分析表明，BnYUCCA8蛋白是一个不稳定的疏水性蛋白，与埃塞俄比亚芥和甘蓝中YUCCA8蛋白的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明，BnYUCCA8在叶和根中表达量最高，花和角果中表达量相对较低，且苗期表达量高于花期。随低温胁迫加剧，BnYUCCA8表达量总体呈降低趋势，且‘天油2288’(下胚轴伸长较长的弱抗寒品种)较‘16VHNTS158’(下胚轴伸长较短的强抗寒品种)基因表达量高。内源IAA含量的测定结果表明，在低温处理24 h时，‘16VHNTS158’中IAA含量在4℃、0℃、-4℃较常温(22℃)分别降低68%、92%、97%,‘天油2288’中分别降低了77%、89%、94%,且‘16VHNTS158’较‘天油2288’IAA含量在常温、4℃、0℃、-4℃分别低19%、14%、40%、39%。对BnYUCCA8相对表达量、内源IAA含量和下胚轴...     

不同作物种子耐热性评价及油菜种子耐热性全基因组关联分析

全球气候变暖对作物生长发育和产量形成等造成不良影响。对不同作物种子进行耐热性评价，挖掘种子耐热相关基因对于提高作物应对高温胁迫的抗耐性具有重要理论和实践意义。为探索种子耐热性差异，本研究以18个不同作物品种（系）的种子为试验材料，在近100℃高温下分别处理2 h、4 h、6 h、8 h和12 h后统计发芽势和发芽率，结果表明，不同作物种子高温耐受力具有显著差异，但总体趋势是发芽势和发芽率随着处理时间延长而不断降低。芝麻和部分油菜品系的种子耐热性最强，热处理12 h后的发芽势和发芽率仍在50%以上，小麦、水稻、大麦、红花的耐热性中等，花生的耐热性最差，热处理2 h后发芽势和发芽率已下降至10%或以下。为挖掘油菜种子耐热性相关基因，以114份甘蓝型油菜种质资源为材料，在100℃下处理8 h，利用60K SNP芯片数据对2个环境下的发芽势和发芽率进行全基因组关联分析。结果检测到11个与发芽势关联的SNP位点，2个与发芽率关联的SNP位点。在候选区间范围内共筛选到16个耐热相关基因，部分基因的同源基因已有文献报道在其它植物高温胁迫响应中发挥着重要作用。     

479份芥菜型油菜种质资源萌发期耐盐性综合评价

为了解不同芥菜型油菜种质资源的耐盐程度，本研究利用0、150、200和250 mmol/L浓度的NaCl溶液对479份来自不同国家的芥菜型油菜种质资源进行盐胁迫处理，并测定发芽率、根长、芽长和鲜重；采用主成分分析、隶属函数、多元线性回归分析和聚类分析对参试材料的耐盐性进行综合评价。结果发现在200 mmol/L的NaCl溶液处理下，可以有效地将479份材料划分为4类，第I类为耐盐品种12份，第Ⅱ类为75份中等耐盐品种，第Ⅲ类为313份不耐盐品种，第Ⅳ类为79份盐极敏感品种，并建立了芥菜型油菜耐盐性鉴定的多元线性回归方程，y=0.537x1+0.310x2+0.089x3+0.064x4。筛选得到的耐盐性材料为培育油菜耐盐新品种奠定基础。