猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用

根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的核酸进行扩增,均无PCV3目的条带出现;随机抽取扩增的16份临床病猪样品目的条带进行TA克隆后测序,结果显示均为PCV3特异性目的片段,16株PCV3江苏毒株扩增序列与已报道的PCV3/US/SD2016和PCV3/CN/Hubei-618基因序列同源性分别为98.4%~99.6%、99.0%~99.8%,而16个毒株之间的同源性为98.3%~100%。利用所建立的PCR方法检测了2014~2017年间收集的江苏省临床病猪样品938份、健康猪样品500份,PCV3的阳性检出率分别为6.93%和0.6%;其中,2014年病猪样品中的阳性率为1.92%,后呈逐渐上升的趋势,2017年达到12.67%。本研究表明,建立的PCR方法特异、敏感,可以用于临床PCV3的检测;PCV3在江苏省猪群2014年已有感染,并呈逐年升高的趋势,应予以重视。     

桑树幼叶cDNA文库的构建及部分表达序列标签分析

基于为鉴定和克隆桑树功能基因提供基础信息的目的,采用RNA转录5′末端转换(SMART)法构建了桑树幼叶全长cDNA文库。该文库容量为1.02×106pfu/mL,重组率95%,符合构建基因文库的质量要求。从构建的桑树幼叶cDNA文库中随机挑取48个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为32条,经UniGene数据库归并后为32条,UniGene比率为100%;与NCBI核酸数据库进行比对、查询和注释,在32条序列中有29条序列具有同源性,其中16条为全长序列,完整性比率为55.2%;初步发现具有已知功能基因的ESTs 6个,具有推测功能基因的ESTs 5个,未命名或未知功能基因的ESTs 21个。     

Fh8明显增强PCV2 Cap蛋白的可溶性表达及抗原性

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的主要功能蛋白Cap蛋白,很难在体外获得可溶性表达。本研究旨在以Fh8蛋白为融合标签实现PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的可溶性表达,以小鼠评价可溶性Cap蛋白的抗原性。以病毒基因组为模板,扩增ORF2靶基因,插入p Cold原核表达质粒,成功构建的p Cold-ORF2阳性质粒转入大肠杆菌BL21中。利用SDS-PAGE分析Cap蛋白的可溶性表达情况,利用Western blotting鉴定Cap蛋白的反应原性。重组蛋白与佐剂乳化制备免疫原,免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中Cap抗体,利用PCR检测组织脏器中病毒载量,以评估可溶性Cap蛋白的免疫原性。PCR结果表明,Fh8和PCV2 ORF2基因被成功扩增。SDS-PAGE结果表明Fh8标签显著提高了ORF2在大肠杆菌中的可溶性表达,分子量35 000。Western blotting结果显示,猪PCV2阳性血清能够特异性的识别可溶性Cap蛋白。小鼠一次接种Cap蛋白28 d后,抗体全部转阳,免于PCV2的攻击。表明通过新型小标签实现了PCV2 ORF2基因的可溶性表达,且具有良好的免疫原性。     

重庆地区犬圆环病毒检测及序列分析

本试验旨在调查近年来新发的犬圆环病毒（canine circovirus,CCV）在重庆地区的流行情况,探索重庆流行毒株的特性。本研究利用PCR方法对2017年采集于重庆地区的100份犬血清样品进行CCV核酸检测,对所得CCV阳性样品进行全基因组扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 6.0和RDP4等软件对分离到的重庆CCV毒株进行分析。结果显示,重庆地区100份犬血清中共有4份为CCV阳性,阳性率为4%,从4份阳性样品中共获得3株不同的CCV基因组（CQ76、CQ79和CQ82）,全长基因组序列均为2 062 nt,与此前报道长度为2 063 nt的CCV基因组相比缺少了一个碱基,该碱基位于5'-基因间隔区内茎环结构的下游。3个毒株的两个ORF之间5'末端间隔区和3'末端间隔区长度分别为134（1 929-2 062 nt）和203 nt（913-1 115 nt）。CQ76、CQ79和CQ82的同源性在99.8%~100%之间,其中CQ76与CQ82仅在第2 019位点存在同义突变;所获得的3个重庆毒株与国内外报道的其他CCV基因组序列同源性为82.7%~97.1%,其中,ORF2的变异程度大于ORF1。基于病毒ORF2序列和全基因组分别构建NJ进化树中,CQ76、CQ79和CQ82均属于同一亚群,与属于基因Ⅱ型的中国毒株204株遗传距离较近,同源性为96.5%~96.7%。RDP4重组分析发现,CQ76、CQ79和CQ82毒株基因组均为广西毒株204株和388株的重组序列,重组区域坐落于ORF2。本研究为丰富CCV流行病学和遗传进化信息,以及进一步防控研究提供基础数据。     

猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析

[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对 PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过 PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株 PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在 PK15细胞上增殖,特异性 PCR检测可扩增出特异性片段,经 PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其 TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%～96.8%;与 AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ 和AF055392属于基因型 PCV2a,与 PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区 PCVAD的防控提供了理论依据。     

桃树花芽分化期间枝叶细胞分裂素和赤霉素类物质的含量变化

本文报道了白凤花芽分化期间枝叶的细胞分裂素类物质(CTKs)和赤霉素类物质(GAs)的含量变化。用苋红合成法测定CTKs,大麦胚乳法测定GAs。结果如下:短枝和长枝中部的花芽分化开始期为7月27日,长枝上部为8月6日;枝叶生长期内源GAs含量高,快速生长期最高;枝叶停长后,内源GAs含量一直很低。梢尖和中部叶是GAs的主要分布场所。GAs为成花抑制物;花芽分化前30～40天所有样本均有一个CTKs含量高峰。CTKs来自根系并为成花促进物;叶芽可在枝叶生长、CTKs/GAs很低时活动并抽生二次枝。枝叶停长、CTKs/GAs上升后花芽开始活动。     

犬圆环病毒Cap蛋白的生物信息学分析及原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是近年被发现的圆环病毒属新成员,获取CaineCV Cap蛋白,为研究Cap蛋白的功能以及抗原表位奠定了基础。本研究以CaineCV GX2017株基因组作为模板,使用PCR方法扩增出Cap蛋白的基因序列,对其进行生物信息学分析,并克隆至pET-28a原,进行原核表达。结果表明:GX2017的N端2~26位氨基酸存在一个核定位信号,同时含有3个B细胞表位(aa7~aa14;aa150~aa174;aa233~aa253);第134位氨基酸为N-糖基化位点,第169和第238位氨基酸为O-型糖基化位点;进化分析表明,本研究的CanineCV Cap蛋白基因序列与欧美株同源性较低,且处在不同的分支;SDS-PAGE结果显示,重组Cap蛋白在E.coli BL21(DE3)中不能正确表达,切除了NLS的d(1-26)Cap蛋白能在E.coli BL21(DE3)中大量表达;Western blot 分析表明,该重组蛋白能与Anti-His 标签抗体发生特异性反应。本研究成功构建了pET-d(1-26)Cap重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得高水平表达,为进一步制备Cap蛋白的抗体奠定了基础。     

GPS双频接收机C/A码与P码伪距精度的分析和比较

本文主要研究GPS双频接收机C/A码和P码伪距的精度问题,首先阐述了保密P(Y)码伪距的测量原理,然后采用自行编制的精密单点定位程序,利用大量IGS跟踪站观测数据进行了试算,对该问题进行了探讨和分析,结论认为C/A码和P1码伪距的精度基本相同,而P2码伪距观测值的精度较低.     

2013～2014年猪嵴病毒分子检测和3D基因遗传变异分析（英文）

[目的]为调查猪嵴病毒(PKV)在我国哺乳仔猪中的流行和变异情况。[方法]采集2013~2014年我国5个省份27个猪场224份哺乳仔猪腹泻粪样,采用RT-PCR方法对PKV的3D基因进行检测,并对其中的29个PKV3D基因进行序列测定和遗传变异分析。[结果]腹泻粪样中PKV总阳性率为65.18%(146/224),猪场PKV总阳性率为85.2%(23/27);29个PKV3D基因与国内外6株其他PKV株相关序列的核苷酸同源性为87.0%~100%,所推导的氨基酸序列同源性为92.7%~100%。[结论]我国哺乳仔猪中普遍存在PKV感染,PKV 3D基因呈现多样性。