白菜黑斑病抗性鉴定及QTL定位

【目的】鉴定白菜类作物黑斑病抗性,同时进行白菜黑斑病抗病QTL定位研究,为白菜抗黑斑病品种改良提供理论依据。【方法】以喷雾法接种芸薹生链格孢（Alternaria brassicicola）分生孢子液于30 d苗龄的白菜离体叶片或植株,黑暗保湿处理后统计病情指数,比较在接种后不同接种部位和不同保湿天数抗性的差异。以优化后的方法鉴定白菜品种的黑斑病抗性,利用白菜重组自交系（RILs）群体进行黑斑病抗性QTL定位。【结果】优化了白菜黑斑病抗性鉴定方法,并利用该方法鉴定了70份白菜类作物品种的黑斑病抗性,筛选出14份抗黑斑病材料。同时利用白菜RILs群体,定位出两个黑斑病抗性QTL位点,分别位于A05 和A06染色体上。【结论】利用离体叶法对白菜接种芸薹生链格孢,并黑暗保湿处理5 d后进行病情调查可以有效鉴定不同白菜材料对黑斑病的抗性差异,且最大程度区分材料间的抗性水平。白菜类作物中缺少对黑斑病的高抗材料。利用白菜RILs群体,在白菜A05与A06号染色体上各定位出一个黑斑病抗性QTL位点。     

大白菜BrAOP2 基因的遗传多样性及其与硫甙含量的相关性分析

以大白菜品种Chiifu 为试验材料, 采用RT-PCR 技术, 克隆了3 个硫甙合成关键基因
BrAOP2 基因的cDNA 序列（BrAOP2.1、BrAOP2.2、BrAOP2.3）。通过氨基酸同源性比对分析,BrAOP2.1
与BrAOP2.2 的同源性为78%,BrAOP2.1 与BrAOP2.3 的同源性为74%,BrAOP2.2 与BrAOP2.3 的同源
性为81%。通过32 份大白菜重测序数据分析了3 个BrAOP2 基因CDS 序列的遗传多样性,并对其与硫甙
含量的相关性进行了分析。结果表明：在32 份大白菜中共检测到7 种硫甙,其中4-戊烯基硫甙（GBN）
含量和2-羟基-3-丁烯基硫甙（PRO）含量较高,分别占总硫甙含量的23.99% 和23.16%。在BrAOP2.1
基因编码区检测到5 个变异位点,在BrAOP2.2 基因编码区检测到7 个变异位点,在BrAOP2.3 基因编码
区仅检测到1 个变异位点。其中BrAOP2.1 基因的A1051G 变异位点与PRO 含量极显著相关,BrAOP2.2
基因的A560G、C753T、A790G 和T927C 变异位点与PRO 含量显著相关,BrAOP2.2 基因的G825A 位点
与4-羟基-3-吲哚基甲基硫甙（4OH）含量显著相关。     

芸薹种作物抽薹相关基因BrFLC1的CAPS标记

以16份芸薹种作物DH系为试材,通过人工春化处理对其抽薹性状进行了鉴定,明确了材料间抽薹早晚存在显著差异;根据BrFLC1基因序列设计引物进行PCR扩增发现,所有16份材料均获得980 bp的片段。多序列比对与抽薹性的关联分析发现,材料的抽薹早晚与扩增片段的碱基变异相关联,并发现关联位点的碱基变异为限制性内切酶Mva I的识别位点;利用该酶对PCR产物酶切可以将材料明显区分开来,从而建立了BrFLC1基因的CAPS标记（命名为G-Mva I）。利用此标记对96份芸薹种作物DH材料的验证表明,该基因的分子标记结果与抽薹时间表型显著相关,用该标记可以进行分子标记辅助选择。     

大白菜橘红心类胡萝卜素组分及其基因分析

利用高效液相色谱法（HPLC）,根据二极管阵列检测器和标准品的检测结果对橘红心和白心大白菜内叶类胡萝卜素组分进行鉴定;以橘红心大白菜自交系‘A21530’和白心大白菜自交系‘A21445’为亲本构建了一个269 单株的F2 分离群体,进行橘红心基因精细定位;根据大白菜基因组注释信息,筛选橘红心候选基因并克隆测序分析;基因内部开发标记,在F2 群体进行候选基因验证。研究结果表明,橘红色是由于前番茄红素（7, 9, 7′, 9′–四顺式–番茄红素）、9–顺式–β–胡萝卜素、前链孢红素（7, 9, 9′–三顺式–链孢红素）和其他胡萝卜素组分积累造成的。通过精细定位将橘红心基因定位于A09 号染色体末端,其两侧紧密连锁的标记是SB13037 和SB13049,这两个标记各有一个重组单株,与橘红色基因分别相距0.3 和1.1 cM,物理距离为98.904 kb。根据大白菜基因组注释信息,分析定位区域的23 个基因,筛选出1 个编码类胡萝卜素异构酶的基因CRTISO,基因编号Bra031539。测序结果表明,Bra031539 的编码区有53 个SNP 和6 个碱基缺失,造成12 个氨基酸突变和2 个谷氨酸的缺失。根据缺失突变位点设计标记,在F2 群体中进行验证,结果表明候选基因与橘红心性状共分离。     

控制大白菜和白菜型油菜叶缘裂刻的QTL 定位及分析

 利用叶缘光滑无裂刻的大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour）Olsson]材料‘Z16’和叶缘深裂的白菜型油菜（Brassica campestris L. var. yellow sarson Prain）‘Yellow Sarson 143’构建的120 个株系的BC₂DH 群体及已构建的包含10 个连锁群的遗传图谱,利用JoinMap4 软件及MQM 作图法,对叶缘裂刻性状进行QTL 定位分析。3 次重复试验中,分别在第3、10 号染色体上的相同位置各检测到1 个控制叶缘裂刻性状的QTL,具有重复性。各QTL的LOD值在7.66 ~ 18.99 间,可解释26.4% ~ 44.7%的表型变异。通过大白菜与拟南芥注释基因比对,生物活性赤霉素（GA₁、GA₄）合成的关键基因BrGA20ox3位于第10 染色体的QTL 区域,对143 施加外源赤霉素GA₃ 能明显抑制叶缘裂刻表型,因此BrGA20ox3为控制叶片裂刻的可能候选基因。对BrGA20ox3 克隆测序获得与该基因共分离的特异标记（BrIDlobe-2）,对进一步研究叶缘裂刻性状及分子标记辅助育种具有重要的意义。     

大白菜回交导入系群体构建及其遗传分析

 利用大白菜栽培品种的DH系Z16和白菜型油菜自交系L144杂交的F1获得包括119个株系的DH群体。用相同亲本的F₁与Z16进行独立回交, 利用25个独立回交的BC₂分别得到这些株系的DH系,选择每个BC₂的4~6个DH系构建121个株系的BIL群体。进一步利用SSR和SRAP标记构建了DH群体遗传图谱, 由10个连锁群组成, 包括245个分子标记, 总长度714 cM, 平均遗传图距2.9 cM。再以此图谱为参照, 用锚定在染色体上的97个SSR标记研究供体亲本L144的染色体片段在B IL群体中覆盖基因组比率。在BIL群体中来源于L144的基因组片段占0.84% ~35.00% , 平均为11.31% , 接近理论遗传预期值12.50%。在25个BC₂的BIL株系中供体亲本L144等位位点占1.69% ～27.36% , 平均为11.03%。     

大白菜DH群体TuMV抗性的QTL定位与分析

 利用已构建的包含287个标记位点的遗传图谱的大白菜DH群体,采用多模型QTL作图的方法,通过苗期人工接种TuMV-C₄株系对来自抗病亲本Y195 93和感病亲本Y177-12的DH群体的TuMV抗性进行QTL分析。共检测到3个QTLs,分别位于R03、R04和R06连锁群上,解释的表型变异在10.5%~21.9%之间,3个QTLs可解释40.0％的表型总变异。其中位于R04上命名为Tu-2的QTL解释的表型变异最高,为21.9%,其余两个位于R03和R06上的QTLs,分别解释10.5%和14.5%的表型变异。     

小白菜小孢子培养再生植株的倍性与基因组DNA甲基化的关系

对小白菜品种进行游离小孢子培养,得到9株再生植株,其中2株为单倍体,7株为二倍体,二倍体自然加倍率为77.7 %。为 避免材料间差异,取单倍体和二倍体再生植株各2株,提取单株DNA,分别构建单倍体和二倍体DNA混合池。利用甲基化敏感性限制性 内切酶-PCR法,结合SRAP分子标记技术,对2个DNA混合池进行筛选,共筛选768对引物,只有在未酶切的单倍体和二倍体DNA池中SRAP 引物扩增无差异,而酶切后有差异的条带,才认为是单倍体和二倍体甲基化差异。试验共获得8对含有多态性的引物,试验结果证明 小白菜小孢子培养获得的再生植株的倍性与基因组DNA甲基化有关。     

基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF基因表达载体的构建

随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。     

芸薹种作物开花相关基因BrFLC2的InDel标记

 以具有不同开花习性的9份芸薹种作物为试材,根据开花相关基因BrFLC2序列设计引物进行PCR扩增,发现9份材料均获得约1 400 bp的片段。通过克隆测序分析发现9份材料存在片段大小差异,因此开发了与此相关的BrFLC2的InDel标记。通过对来自8个不同栽培种群的146份自然群体材料的基因型检测与开花时间的相关性分析发现：开花时间早晚与BrFLC2的InDel的基因型显著相关（r = 0.412,P < 0.01）。Del基因型材料开花时间（平均71 d）明显比In基因型（平均109 d）早。研究证明该标记与开花时间表型显著相关,可以用来进行分子标记辅助选择育种。