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[目的]建立Toll样受体3(TLR3)基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据.[方法]采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)打靶载体pTALEN-TLR3,经酶切和测序验证其连接正确后,通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞,转染后提取细胞DNA,用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性.[结果]TALENs左右臂分两部分连接,首先完成A、B部分的各自连接,然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接,TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示,T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性,T2R有3个克隆呈阳性.T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板,经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切,酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强,共获得3条条带(931、555和376 bp).TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化,并加入800μg/mL G418进行筛选,7 d后获得细胞单克隆;挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序,结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系,均缺失7 bp的核苷酸碱基,为非3整数倍碱基缺失,可造成后续基因移码突变,使细胞基因功能失活.[结论]通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系,且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究. 相似文献
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本研究旨在通过45 d的饲养试验,评价4种复合生物制剂对鲫鱼的生长性能及血清免疫、抗氧化和理化指标的影响,继而通过15 d的CCl4攻毒试验,观察4种复合生物制剂对鲫鱼肝脏的保护作用。研究结果表明:日粮中添加5%复合生物制剂Ⅳ组效果最佳,鲫鱼45 d增重率和血清碱性磷酸酶(AKP)及超氧化物歧化酶(SOD)活性(P<0.05)分别比对照组提高了9.5%、16.3%和24.1%;饵料系数比对照组降低了6.9%(P<0.05);血清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性也较对照组降低(P≥0.05);粪便中异养菌的含量比对照组提高了2.7倍,其粪便中芽孢的含量比对照组提高了11.4倍;CCl4攻毒14 d后,四种复合生物制剂对肝脏有明显保护作用。综上,在饲料中添加益生菌、酶制剂和植物提取物复合而成的生物制剂可改善鲫鱼的生长性能和机体抗病能力,是抗生素替代品的选择之一。 相似文献
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在IT行业,随着企业创新活动的日益增多,越来越多的企业会将项目管理纳入其核心管理体系。项目管理办公室(PMO)的搭建不仅仅是为多个项目组提供一个支持的信息化,更重要的是在公司中部署了一个项目管理方法体系,以便企业能在未来的一段时间内长期使用。本文将对IT项目办公室(PMO)进行探讨。 相似文献
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为了解狂犬病病毒(RV)的变异情况,本研究对广西不同地区的22个RV分离株的L基因3'端片段进行克隆和测序,与国内外发表的RV街毒、固定毒株及类RV株相应部分的多态性进行了比较分析.结果表明.所测定的22个广西RV野毒分离株属于基因I型,可分为3个群即I群、Ⅱ群和Ⅲ群.其中13株属于I群,其核苷酸同源性为96.9%~100.0%,氨基酸同源性为98.2%~100.0%;8株属于Ⅱ群,株核苷酸同源性为96.5%~99.7%.氨基酸同源性为97.8%~100.0%.仅1株属于Ⅲ群.22个RV分离株与RV固定毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为79.5%~86.9%和85.8%~96.5%,与类RV核苷酸和氨基酸的同源性分别为65.7%~70.3%和70.4%~76.5%. 相似文献
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【目的】明确猪源肿瘤坏死因子α(TNF-α)多克隆抗体的特异性和反应性,并探索猪瘟病毒(CSFV)感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响,为揭示CSFV的致病机理打下基础。【方法】提取CSFV病料基因组RNA,通过RT-PCR扩增TNF-α基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α并转化BL21感受态细胞诱导表达融合蛋白,经纯化和浓缩后免疫SPF级昆明小鼠制备TNF-α多克隆抗体;同时构建真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α,分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞表达融合蛋白,通过Western blotting、ELISA和间接免疫荧光分析等方法检测TNF-α多克隆抗体效价、反应性及特异性。【结果】以原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导后能表达出约43 kD的融合蛋白,且主要以包涵体形式进行表达。以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染HEK-293T细胞可表达出25 kD的融合蛋白,主要在细胞质中表达,且均匀分布。制备获得的TNF-α多克隆抗体能与转染HEK-293T细胞表达的融合蛋白TNF-α及PK-15细胞的内源蛋白TNF-α发生良好反应,即具有较好的反应特异性,其抗体效价高达1∶8000。CSFV能刺激PK-15细胞分泌蛋白TNF-α上调表达,且TNF-α与其下游因子(TRAF1)的表达变化趋势基本一致,即二者间存在一定关联性。【结论】制备获得的TNF-α蛋白抗体具有效价高、反应性好及特异性强的特点,可用于检测CSFV感染后真核细胞中过表达的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1产生,参与TRAF1相关信号通路而发挥其生物学功能,CSFV感染PK-15细胞后TNF-α和TRAF1的表达变化趋势基本一致,说明CSFV能刺激TNF-α和TRAF1信号通路,使机体产生炎症反应。 相似文献
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为探明养殖欧洲鳗鲡不同体位及其养殖水体中可培养菌群的组成结构,本研究利用16S rDNA序列分析法对从精养池鳗鲡的鳃部、肠道和表皮及其养殖水体中分离得到的可培养细菌进行了分子鉴定并构建了系统发育树。研究结果显示,鳃部、肠道、表皮和水体的菌密度分别为1.6×10^6 cfu/g、2.2×10^7 cfu/g、1.4×10^4cfu/cm2和4.5×10^3 cfu/mL;分离菌株分别属于γ-变形菌纲的肠杆菌属、不动杆菌属、栖水菌属,β-变形菌纲的食酸菌属,芽孢杆菌纲的葡萄球菌属、气球菌属,黄杆菌纲的金黄杆菌属和放线菌纲的微球菌属等5大类8个菌属。其中,微球菌属、肠杆菌属和栖水菌属分布最广,各样品中均有检出;而气球菌属和食酸菌属仅在鳃部分布。各生态位中,鳃部菌群最为多样,含有葡萄球菌属之外的7个属;而水体菌群种类最少,只有4个属。此外,菌群组成含量的分析结果表明,鳗鲡鳃部以金黄杆菌属(28.3%)和肠杆菌属(26.1%)居多;而肠道、表皮和养殖水体都以微球菌属占绝对优势,分别为43.6%、53.5%和74.8%。 相似文献
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基于淮河流域1960-2015年61个气象站点地面0cm日最低气温资料,采用线性倾向估计、反距离加权、Mann-Kendall突变检验、滑动T检验方法,分析近56a淮河流域初霜日、终霜日和无霜期的时空变化特征及突变年份。结果显示:(1)研究期内,淮河流域平均初霜日期 、终霜日期和无霜期分别以2.15、2.49、4.38d·10a-1的速率呈推迟、提前、延长的趋势(P<0.01),其中,在20世纪90年代的变化最为显著(P<0.01),速率分别为16.38、5.34、20.6d·10a-1。(2)平均初霜日期在空间上呈北早、南迟,山区早、平原迟的分布;86.9%的站点初霜日期呈显著推迟趋势(P<0.05)。终霜日期呈西南早、东北迟,平原早、山区迟的分布;83.6%的站点通过0.05水平的显著性检验,以3.44~5.92d·10a-1的速率呈提早趋势。无霜期随纬度和海拔升高而缩短;93.4%的站点通过0.05水平的显著性检验,变化率为3.56~7.59d·10a-1,无霜期整体延长。(3)11月8日线、4月1日线、220d等值线位置较其它各气候基准期和各年代分别偏北约1个和2个纬距,在32°N和34°N附近的偏北趋势最为明显,佐证了该区初霜日期整体推迟、终霜日期整体提前、无霜期整体延长的趋势。(4)初霜日期、终霜日期和无霜期分别在2002年、1995年和1998年发生突变。 相似文献
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根据GenBank中猪肺炎支原体(Mhp)J株P36蛋白基因(登录号X67286)的核苷酸序列设计1对引物,建立了快速检测Mhp的PCR方法。该方法能扩增出948bp的Mhp特异性条带,其敏感性达到可检测出0.735ng的MhpDNA,但对鸡毒支原体、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒均未检测出相应目的条带;将克隆获得的目的片段与GenBank已发表的MhpJ株的P36基因进行比较,同源性达到99.9%。采用所建立的PCR方法对42份疑似猪支原体肺炎(MPS)病料进行临床诊断,发现有13份呈阳性(31.0%)。可见,该PCR方法适合于MPS的临床诊断,可为其防控提供可靠依据。 相似文献
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正狂犬病(Rabies)是由弹状病毒科的狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)侵入中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)引起的一种高度嗜神经性急性致死性人兽共患传染病,也称"恐水症",俗称"疯狗病",可导致包括人在内的几乎所有温血动物死亡。狂犬病呈世界性流行,WHO估计全球每年约5.9万人因该病死亡,其中95%人患狂犬病由疯狗咬伤引起[1]。亚洲每年有1 100万人被犬咬伤,中国是受该病危害最严 相似文献