单一引物标记LUX荧光RT-PCR鉴别BTV和EHDV

采用在线LUXTM专业软件,根据BTV-NS3基因序列和EHDV-NS3基因序列,通过特异性单一引物序列3′末端的荧光标记,分别设计出两对BTV和EHDV的LUX荧光PCR引物,并采用BLAST软件对各引物进行匹配性和特异性分析,根据分析结果选择合适的引物合成。经过各反应条件的优化和特异性、敏感性试验,并对BTV、EHDV、VSV、PPRV、BVDV、AKV的BHK-21细胞培养物和临床样品检测,与常规RT-PCR进行对比检测,建立了能同时鉴别检测BTV和EHDV的二重LUXTM荧光PCR方法。该二重LUXTM荧光PCR的BTV和EHDV各自引物只对相应的病毒呈阳性反应,两者没有交叉反应现象,对健康牛、羊和猪基因组DNA、BKH-21细胞对照,以及其他几种相似疾病如VSV、PPRV、BVDV、AKV均呈阴性反应。该法对病毒的细胞培养液鉴别检测敏感性可达1TCID50C以上,比常规RT-PCR敏感性提高10倍以上,从样品核酸纯化到完成二重LUXTM荧光PCR反应和熔解曲线分析,仅需3h,在进出口动物检验检疫中快速鉴别BTV和EHDV具有实际应用价值。     

猴D型反转录病毒Ⅰ型抗体免疫梳检测方法的建立及应用

为建立猴D型反转录病毒Ⅰ型抗体(SRV1)的快速检测方法,本试验采用基因工程技术制备SRV1的SRV1-30基因原核表达产物重组SRV1-30蛋白作为抗原诊断试剂,建立免疫梳方法用于特异性检测实验猴血清中抗SRV1的抗体IgG。结果显示,最佳抗原包被量为100 mg/L;制备好的免疫梳均能够特异性检测到相应的猴SRV1病毒阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应,表明该检测方法特异性强;敏感性分析结果表明,SRV1-30蛋白能够敏感地检测到1∶200倍稀释的SRV1阳性血清;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法在对12份可疑猴血清样品进行检测,免疫梳方法与ELISA检测结果一致率为100.0%,Kappa=1.000。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

不同施肥量对成熟期烟叶生长及产量和质量的影响

对K326进行不同施肥量处理后发现，烟叶叶绿素、可溶性蛋白含量和采收天数随施肥水平的升高而增大，随着成熟度的递进而降低；叶面积、产值量随施肥水平的升高和成熟度的递增先升高后降低；产值量和化学成分分析发现，同部位烟叶以适肥处理为最好，其次为过肥处理和欠肥处理。结果表明，适肥处理有利于形成良好的烟叶品质。     

不同钝化剂配施硫酸锌对石灰性土壤中镉生物有效性的影响研究

为了降低轻度镉（Cd）污染土壤中Cd的生物有效性以确保农产品安全,以低吸收豆类蔬菜（豇豆）作为供试植物,通过田间试验研究了在轻度Cd污染（Cd1.5mg·kg-1）石灰性土壤中施加赤泥、油菜秸秆、玉米秸秆、赤泥＋油菜秸秆等钝化处理并配施硫酸锌肥料对土壤中Cd的生物有效性的影响。结果表明,与对照相比,不同钝化处理可显著（P〈0.05）降低豇豆豆角中Cd浓度和土壤中可溶态Cd浓度;钝化处理条件下豇豆豆角中Cd浓度降低了27%（玉米秸秆）~83%（赤泥＋油菜秸秆）。在施加钝化剂的基础上,配施硫酸锌肥料可进一步降低豇豆对Cd的吸收,各钝化处理在配施锌肥后,豇豆豆角中Cd平均浓度与未施锌肥相比降低了27%。对不同作物秸秆而言,富含巯基的油菜秸秆比富含纤维素的玉米秸秆钝化效果好。由此可见,在轻度Cd污染的石灰性土壤中,无机钝化剂赤泥和富含巯基的油菜秸秆复合使用是一种高效且环境友好的钝化手段。同时,合理施用锌肥可能会进一步降低作物对Cd的吸收。     

实时荧光定量PCR检测畜禽肉制品中鸭源性成分

根据鸭mtDNA COX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR用于检测畜禽肉制品中的鸭源性成分。结果表明,建立的方法特异性强,与鹅、鸡、羊、牛等15种动物DNA无非特异性扩增;灵敏度高,可检测1.0pg/μL鸭源DNA的存在;重复性好,同DNA浓度所测得Ct值的变异系数均小于3%;应用该法对模拟混合样品进行检测,结果与预期相符,且常见肉类DNA的存在并不影响该法对鸭源性成分检测的灵敏度。说明本试验建立的鸭源性成分实时荧光定量PCR法特异、敏感、稳定,可快速准确检测畜禽肉制品中含有的鸭源性成分。     

冬油菜替代种植技术对华北典型镉铅污染农田适用性研究

为探究冬油菜替代种植技术在我国华北地区镉(Cd)、铅(Pb)污染农田土壤中的适用性特征,本研究在河南省济源市Cd、Pb污染农田开展田间试验,选用冬油菜(Brassica napus)秦油1号和三月黄为供试植物,在不同大气沉降和土壤污染程度条件下研究两种供试油菜不同部位中Cd、Pb含量及富集量,油菜对土壤中Cd、Pb的去除率,以及菜籽油和饼粕中Cd、Pb含量。结果表明,秦油1号油菜生物量普遍高于三月黄。三月黄油菜对Cd富集量较高,达9.469 g·hm^-2,秦油1号对Pb富集量较高,达53.856 g·hm^-2,整体上两种油菜对土壤中Cd的去除率(0.081%～0.843%)高于对Pb的去除率(0.000 6%～0.074 3%)。在大气沉降程度较低但土壤污染严重的试验区,两种油菜吸收的Cd均集中在茎部,Pb集中在根部;而在大气沉降程度较高的试验区,不同的土壤污染程度下,油菜将吸收的Cd、Pb更多富集在荚部。在常规物理压榨和丁烷低温萃取两种不同制油工艺处理下,菜籽毛油和饼粕中Cd、Pb含量均较低,符合国家相关标准,菜籽油可安全食用,油菜饼粕可作...     

非洲马瘟间接ELISA方法的建立及初步应用

为建立检测非洲马瘟间接酶联免疫吸附试验方法,利用重组杆状病毒感染昆虫细胞表达出具有良好抗原性的VP7蛋白,将感染VP7重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液作为包被抗原,通过优化包被抗原浓度、二抗稀释度等,建立了检测非洲马瘟的间接ELISA方法,并进行了初步运用。结果表明,直接利用真核细胞表达VP7蛋白的昆虫细胞裂解液作为包被液可成功建立检测非洲马瘟的间接ELISA方法。     

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用

为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊断牛结核病,利用胶体金免疫层析技术原理,用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条.结果表明,粒径为40 nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.0,MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5 μg,MPB70抗原的最适包被浓度为3.0 mg/mL,抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5 mg/mL,交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性.比较试验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条.在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较.本试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%.快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景.     

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的建立

依据非洲猪瘟病毒(ASFV)的vp73基因保守序列,设计了特异性引物与TaqMan探针,扩增片段69bp,建立了ASFV实时荧光PCR检测方法。与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对,结果显示,本文建立的方法与OIE两种检测方法的特异性相当,灵敏度与OIE荧光PCR方法相当,但比普通PCR方法高出至少10倍。标准定量曲线显示,本文方法最低检测限可达10 copies/μL病毒DNA(相关系数为0.993046)。重复性试验的批内CV值为0.61%～1.14%,批间CV值为1.37%～3.14%,表明本文方法的重复性和稳定性良好。可见,本文建立的基于vp73基因的ASFV实时荧光PCR检测方法具备快速、准确、灵敏的特点,将为检验检疫部门防御ASFV传入我国提供更多技术支持。