基于RNA-Seq技术的牦牛体外受精胚胎发育转录组分析

【目的】探明不同发育阶段牦牛体外受精（IVF）胚胎的转录组差异,了解差异表达基因（DEG）在功能、分类和代谢通路的差异,为揭示牦牛早期胚胎发育调控机制,促进牦牛胚胎体外生产技术的发展提供理论基础。【方法】以IVF技术生产的牦牛2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个发育阶段的胚胎为样本分别提取总RNA,采用Smart-Seq2扩增技术构建5个测序文库,应用HiSeq^TM 2500高通量测序技术进行转录组测序,对获得的有效序列进行功能注释及相关生物信息学分析。【结果】牦牛IVF后的卵裂率和囊胚率分别为69.3%和26.2%。2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个发育阶段的牦牛胚胎Clean reads为47 355 570-50 855 888条,其中有85.65%-90.02%的reads能比对到牦牛参考基因组序列上;8-细胞的胚胎比对上的转录本最多（14 893）,而囊胚比对上的转录本最少（9 827）。牦牛胚胎转录本主要有5种可变剪接类型,转录起始区域可变剪接（TSS）和转录结束区域可变剪接（TTS）所占比例最大;牦牛2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚基因组分别有116 601、234 131、196 420、70 841和94 840个位点存在单核苷酸多态性（SNP）。在4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚期开始表达的基因分别有1 221、1 116、142和564个;随着胚胎发育的进行,BMP15、KIT、GDF9、STAT3、ZP3和ZP4等母源基因的表达量逐渐减少,而SARS、IL18、ACO2、TXN2、ATP5B、PCGF4、UBE3A、MAPK13、SNURF和JUP等胚胎基因的表达量则逐渐增加。以|log₂ratio| ≥1且Q-value ＜ 0.05为筛选标准,在2-细胞和4-细胞胚胎、4-细胞和8-细胞胚胎、8-细胞胚胎和桑椹胚以及桑椹胚和囊胚比对中分别筛选到6 922、7 601、8 071和10 555个DEGs。GO分析表明,4个发育阶段的DEGs归类注释都涉及生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3大类62个二级条目。通过KEGG pathway数据库分析,2-细胞和4-细胞期胚胎的DEGs参与到308条通路中,显著富集剪接体、RNA转运和泛素介导的蛋白水解等11条通路;4-细胞和8-细胞胚胎的DEGs参与到310条通路,显著富集嗅觉转导、神经活性配体-受体互作和核苷酸切除修复等9条通路;8-细胞期胚胎和桑椹胚的DEGs参与到316条通路,显著富集嗅觉转导、泛素介导的蛋白水解和神经活性配体-受体互作等10条通路;桑椹胚和囊胚的DEGs参与到315条通路,显著富集剪接体和RNA转运2条通路。【结论】利用高通量测序技术对牦牛IVF胚胎不同发育阶段的转录组进行测序和分析,揭示了牦牛胚胎发育不同阶段差异表达基因的数量,获得了差异表达基因的功能、分类和代谢通路。为丰富牦牛胚胎转录组信息,揭示牦牛胚胎发育分子调控机制及完善其胚胎体外培养技术研究奠定基础。     

牦牛CCND2基因的克隆及其在不同发情时期卵巢中的表达

【目的】研究牦牛细胞周期蛋白D2(Cyclin D2,CCND2)基因序列特征及其在牦牛不同发情时期卵巢中的表达。【方法】以牦牛为研究对象,提取卵巢的总RNA进行反转录为第一链c DNA,根据Gen Bank中黄牛CCND2的m RNA序列(Gen Bank登录号:NM_001076372.1),使用Primer 5.0软件设计引物。应用PCR方法对CCND2基因扩增克隆,并测序获得CCND2基因完整的CDS区序列及部分5′端和3′端UTR区。使用Protparam、SOPMA、SWISS-MODEL及SMART分别对牦牛CCND2蛋白的理化性质、二级结构、三级结构及结构域进行预测分析,并进行同源性分析和系统进化树构建,利用半定量PCR方法对CCND2基因在牦牛各组织中的表达进行检测;同时采用实时荧光定量PCR技术分析CCND2基因在牦牛不同发情时期(卵泡期、红体期、黄体期)卵巢中的相对表达量。【结果】克隆获得牦牛CCND2基因序列为909 bp,其中包含可编码289个氨基酸残基的长为870 bp的CDS区。与黄牛相比,牦牛CCND2的CDS区存在5个碱基突变,导致其中一个氨基酸改变。牦牛CCND2基因CDs序列与野牦牛、黄牛、印度水牛、绵羊、野猪、马、家犬、猫、人类的进行比对同源性分别是99.54%、99.31%、99.31%、98.16%、94.81%、90.46%、90.80%、91.49%、88.62%,物种之间同源性较高,与进化树分析显示的亲缘关系远近一致,表明CCND2基因编码区在进化中较为保守。对CCND2蛋白预测分析知牦牛CCND2基因编码蛋白的分子式为C1445H2315N377O440S18,相对分子质量约为32.59k D,理论等电点为4.75,总平均亲水性为-0.107,不稳定指数为44.56,属亲水不稳定的酸性蛋白,该蛋白无跨膜区和信号肽;二级结构主要包含α-螺旋和无规卷曲,且与三级结构分析结果一致。蛋白含位于第26—152位氨基酸处的Cyclin_N和位于第154—257位氨基酸处的Cyclin_C两个结构域。CCND2基因在牦牛各组织中均有表达,其中在胃、卵巢和脑中表达相对较高;q RT-PCR结果显示在牦牛不同发情时期卵巢中CCND2 m RNA均有表达,且卵泡期卵巢中的表达水平最高(P0.01),在红体期和黄体期卵巢中表达水平无差异(P0.05)。【结论】成功获得了牦牛CCND2基因的CDS区全长序列和组织表达谱,对其进行生物信息分析及蛋白功能结构分析为该基因在牦牛繁殖调控中的进一步研究提供理论依据;在牦牛不同发情时期卵巢中CCND2m RNA表达水平存在差异,可能与卵泡发育过程中颗粒细胞增殖分化、卵泡发生波及卵巢内分泌有关,为进一步研究牦牛卵巢发育机制及改善牦牛繁殖效率提供了基础资料。     

麦洼牦牛乳腺上皮细胞系的建立及其生物学特性

为建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,采用组织块贴壁法及Ⅰ型胶原酶消化法,从麦洼牦牛乳腺组织中成功分离并获得纯化的乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力等生物学特性的检测,建立并鉴定麦洼牦牛乳腺上皮细胞系。结果显示,乳腺细胞形态良好,细胞接种存活率达91%,群体倍增时间26.97h,细胞生长曲线呈典型"S"型,细胞传至25代以上仍保持旺盛的增殖活力。可见,通过对细胞传代及反复冻存和复苏已成功建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞系,获得大量的乳腺上皮细胞,使麦洼牦牛物种在细胞水平上得以保存,为建立牦牛乳腺生物反应器及泌乳调控机制研究提供基础。     

汶川震区典型区不同受损阶段群落多样性特征——以北川县为例

为了解汶川地震灾区典型区域不同受损阶段群落特征,采用野外调查和室内分析相结合的方法,研究了北川县苏保河和魏家沟流域4种植被类型（灾后恢复草地、受损林地、裸地、未受损林地）群落种类组成、垂直结构、多样性等特征。结果表明:不同受损阶段群落在物种组成、物种数量、群落分层等方面差异显著;灾后恢复草地草本层Simpson指数和Shannon Wienner指数最大,Pielou均匀度指数则以裸地最大;灌木层及乔木层多样性指数均以未受损林地最大;总体多样性指数则表现为未受损林地受损林地灾后恢复草地裸地。基于以上分析结果,本文得出地震灾区植物生长条件严重衰退,在植被恢复过程中应采用人工辅助方式,增大其物种多样性及恢复潜力。      

林木内生菌在林业可持续发展中的作用研究进展

林地土壤养分缺失及病虫害严重影响木材产量及其品质,是制约我国林业可持续发展的主要问题之一。为阐明林木内生菌在林业可持续发展中的作用,该文总结了林业可持续发展面临的林地养分失衡、化感作用和林木病虫害等制约因素以及内生菌在促进凋落叶分解、养分循环、提高土壤酶活性、抗逆境、抗病虫方面的研究成果,分析了内生菌改善林下土壤环境和提高林木抗逆的作用机制,建议在今后的研究中应加强对功能菌株的筛选,研制林木内生菌菌肥和生物农药;探究多菌株混合接种对林木生长和抗逆性的影响;以及采用分子标记法研究植物-内生菌的互作机制。     

生殖激素免疫的研究进展

激素免疫是近年来新兴的一门边缘学科,已在医学和畜牧业生产的应用中产生了许多有意义的效果。本文对近年来生殖激素免疫的研究状况,作了比较全面、深入的综述。     

如何预防胚胎移植羔羊难产

胚胎移植，简单地说，就是将通过超数排卵和授精处理的供体胚胎，经手术或非手术移植给经同期发情处理的受体。影响胚胎移植效果的因素很多，饲养管理水平、受体体质等因素会直接影响胚胎移植效果。胚胎移植羔羊难产的原因及防制如下。１胚胎移植羔羊难产原因１．１胎儿过大用做胚胎移植的供体———波尔山羊是较好的肉用山羊品种，其初生重等指标显著高于用做受体的本地品种，加之管理人员对胚胎移植的重视，导致受体羊营养过剩及胎儿过肥。这是引起胚胎移植羔羊难产的主要原因。１．２产道狭窄受体羊的产道狭窄是导致胚胎移植羔羊难产的重…     

KDM2B在小鼠卵母细胞及早期胚胎发育过程中的表达分析

本研究旨在分析KDM2B在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达规律,为KDM2B在卵母细胞减数分裂及胚胎发育过程中的生物学作用奠定基础。选择20只6～8周龄小鼠为试验动物,收集GV期、MⅡ期卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、囊胚各阶段胚胎,根据GenBank上已公布的小鼠(Mus musculus)KDM2B序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测KDM2B在胚胎各阶段mRNA的表达水平;通过免疫荧光染色定位KDM2B蛋白在胚胎各阶段的分布。结果显示,GV期卵母细胞KDM2B mRNA的表达量极显著高于MⅡ期(P<0.01);在2-细胞、4-细胞和8-细胞mRNA表达量较低,囊胚期其表达量极显著升高(P<0.01);卵母细胞成熟过程中,KDM2B在GV期主要表达于细胞核中,MⅡ期卵母细胞核中的荧光信号极显著减弱(P<0.01),早期胚胎发育过程中,KDM2B蛋白在2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎中均不表达,囊胚期重新表达于细胞核。综上表明,本研究成功建立KDM2B在小鼠卵母细胞及胚胎细胞中的时空及时序表达模式,关于KDM2B参与调控减数分裂与胚胎发育过程具体的作用机制有待进一步研究。     

犏牛体外受精胚胎的发育转录组分析

本研究旨在探讨犏牛早期胚胎发育调控机制,为提高犏牛胚胎体外生产效率提供理论基础。以娟珊牛精子体外受精(IVF)牦牛卵母细胞获得的2-、4-、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个阶段的杂种胚胎分别提取总RNA,采用Smart-Seq2扩增、构建测序文库,应用RNA-Seq技术进行高通量测序分析。对HiSeqTM2500测序所得的Raw Reads进行数据过滤后,得到5个发育阶段的犏牛早期胚胎的Clean Reads为47 791 850~63 332 216条,有80.00%~91.13%比对上参考基因的序列。4-细胞期表达的基因数最多(15 400),而桑椹胚表达的基因数最少(9 604)。以log2ratio≥1,Q-value0.05为阈值,获得2-~4-细胞、4-~8-细胞、8-细胞~桑椹胚及桑椹胚~囊胚4个发育阶段的差异表达基因(DEGs)分别为3 690、6 332、8 965和10 298个。GO分析表明,4个发育阶段的DEGs归类注释都涉及生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)3大类67个二级条目。KEGG分析表明,牦牛早期胚胎发育过程中DEGs富集的主要通路有剪接体(Spliceosome)、神经活性配体-受体互作(Neuroactive ligand-receptor interaction)、细胞因子及其受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interactions)、泛素介导的蛋白水解(Ubiquitin mediated proteolysis)、RNA转运(RNA transport)等通路。本研究利用RNA-Seq技术对犏牛体外受精胚胎在发育不同阶段转录组进行了分析,获得了众多差异基因和有关通路的富集,为完善犏牛胚胎体外生产技术提供了理论基础。     

DNA甲基化在哺乳动物卵母细胞和早期胚胎发育中的研究进展

DNA甲基化(DNA methylation)是一种动态、可逆并可以遗传的表观遗传修饰模式,主要发生在哺乳动物原始生殖细胞和早期胚胎发育过程中,能够通过高动态和协同的核酶网络附着在DNA的CpG区域,同时还通过改变调控区域的功能状态进而调控基因表达且不影响DNA序列所携带的遗传信息。DNA甲基化主要涉及基因组印迹、转座元件沉默、X染色体失活和衰老等多种关键生理过程,在哺乳动物卵母细胞和胚胎发育中发挥着重要作用。本文介绍了DNA甲基化的建立与去除机制及其生物学功能,重点阐述了DNA甲基化在哺乳动物卵母细胞和胚胎发育过程中精准生成、维持、读取和删除等动态变化过程,为进一步研究哺乳动物表观遗传调控提供参考依据。