华贵栉孔扇贝MEF2Cs基因克隆及表达特征分析

肌细胞增强因子(Myocyte enhancer factor-2,MEF2)是一种肌肉特异性转录因子,对脊椎动物肌纤维的形成和发育具有重要的调控作用。为了研究MEF2对华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)闭壳肌肌纤维形成和发育的调控作用,实验克隆了华贵栉孔扇贝MEF2C和MEF2C-like c DNA序列,解析了其在不同组织和发育时期的表达调控规律,分析了盐度对其表达调控的影响。结果表明,MEF2C和MEF2C-like基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长为1 302 bp和1 158 bp,分别编码433和358个氨基酸。氨基酸序列比对分析显示MADS和MEF2结构域高度同源,系统进化分析显示华贵栉孔扇贝和长牡蛎具有较近的亲缘关系。在不同组织和发育时期,华贵栉孔扇贝MEF2C和MEF2C-lik mRNA具有相似的表达规律,均在D型幼虫期及闭壳肌中显著高表达。在不同日龄的华贵栉孔扇贝闭壳肌中,MEF2Cs mRNA在60和120日龄表达水平显著升高。MEF2Cs mRNA在盐度为28时表达量最高,说明可能在此盐度下更适合华贵栉孔扇贝生长。     

黑蝶贝苗种中间培育技术的初步研究

以黑蝶贝野生群体人工繁育苗种为研究材料,探索了大、小两种规格和不同吊养深度对黑蝶贝苗海区中间培育的影响。将壳长、体质量分别为(4.12±0.019)mm、(0.07±0.008)g,(2.02±0.012)mm、(0.03±0.005)g两种规格黑蝶贝吊养于2m、4m、5m区,每组黑蝶贝500枚,养殖水温23.09~29.77℃,养殖海区水深8~10m。每隔30d随机抽取50枚贝苗测量壳高、壳长、壳宽、体质量。经180d中间培育,壳长(4.12±0.019)mm的黑蝶贝生长速度明显大于壳长(2.02±0.012)mm的黑蝶贝,表明壳长(4.12±0.019)mm的黑蝶贝出池移入海区养殖较理想。同一规格贝苗在2m、4m、5m养殖水层的成活率差异不显著(P0.05),而3个不同养殖水层中不同规格贝苗养殖成活率差异显著(P0.05)。该研究结果为进一步开展黑蝶贝苗种人工繁育提供了重要参考。     

合浦珠母贝微卫星DNA标记分离与分析

采用生物素标记的（CA）15、（AG）12、（ACA）15、（GATA）8、（GATT）75个探针和磁珠富集法构建马氏珠母贝（Pinctada martensii Dunker）基因组微卫星富集文库。随机挑选500个进行PCR筛选,得到138（27．6％）个候选克隆,测序分析发现130个克隆含有微卫星基重复单元。进一步通过序列比对,最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆,其中包含179个微卫星DNA结构域。获得的微卫星序列中,属于完全型序列的有154条,不完全型重复型序列有19条,复合型重复序列有6条。序列长度为70～490bp,平均295bp。微卫星核心序列两碱基重复3到39次,绝大多数序列重复次数大于10。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在马氏珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物。本研究旨为进一步开展马氏珠母贝分子育种及资源评价分析提供基础资料。     

黄鳍棘鲷家系亲缘关系鉴定

为了建立黄鳍棘鲷微卫星亲子鉴定技术,利用荧光引物和自动测序技术检测了自主开发的12对微卫星分子标记在505尾黄鳍棘鲷个体中的遗传多态性,并构建了亲子鉴定技术。结果显示,该研究中筛选的12个微卫星标记共检测到119个等位基因,平均等位基因数(N_a)为9.91,平均观测杂合度(H_o)为0.651,平均期望杂合度(H_e)为0.661,平均多态性信息含量(PIC)为0.621,具有丰富的多态性。此外,运用Cervus 3.0软件对已知系谱信息的112尾黄鳍棘鲷亲本和393尾子代个体进行模拟分析,结果显示,当双亲未知且置信度为95%时,12个标记的累积排除概率达99.58%;当微卫星标记数量为8时,累积排除概率达到99.1%。因此确定AL49、AL37、AL01、AL20、AL14、AL18、AL15和AL51共8个多态性较高的微卫星标记为黄鳍棘鲷微卫星亲子鉴定的核心体系。在双亲性别未知的情况下,其双亲的累积排除率为99.1%。根据黄鳍棘鲷子代的实际基因分型数据,实际鉴定率为89.31%。该研究构建的微卫星标记组合能为黄鳍棘鲷不同家系混养后的亲子鉴定、种群选育和分子辅助家系管理提供科学的技术手段。     

合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

[目的]研究合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选。[方法]采用生物素标记的5个探针,用磁珠富集法构建合浦珠母贝基因组微卫星富集文库,并对文库进行筛选、测序与引物多态性筛选。[结果]对500个克隆进行PCR筛选,测序分析发现130个克隆含有微卫星重复单元。序列比对后最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆,其中包含179个微卫星DNA结构域。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在合浦珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物,其中8对在种群中（n=32）具有扩增多态性,其多态信息含量PIC值在0．239～0．787;等位基因数在2～9个;观测杂合度介于0．22～0．56;期望杂合度的变化范围为0．25～0．83。[结论]这研究为进一步开展合浦珠母贝的遗传分析提供了基础资料。     

合浦珠母贝家系的建立及生长性状的比较

以经过连续2代群体选育的合浦珠母贝为亲本,采用雌雄单个配对的方法,建立了10个合浦珠母贝家系,对家系的生长性状进行了比较研究。结果表明,壳长的大小顺序为F2>F7>F1>F10>F4=F5>F9>F6>F3>F8;壳宽的大小顺序为F5>F2>F1>F7>F4>F10>F9>F6=F8>F3;壳高的大小顺序为F2>F1>F5>F10>F4>F7>F6>F9>F8>F3;总重的大小顺序为F2>F1>F5>F7>F10>F4>F6>F8>F9>F3。在该批家系中,F2的壳长、壳高、总重均为最大,壳宽虽然小于F5,但无显著性差异,因此认为该家系具有较强的生长优势,可作为进一步选育的材料。通过分析发现,F1、F5家系的各个生长指标总体生长都较快,因此F1和F5家系也具有一定的生长优势,也可以选作为进一步选育的材料。     

鱼类胰岛素样生长因子研究进展

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)主要包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ两种类型,其结构与胰岛素原(pminsulin)相似,因此与胰岛素(insulin,INS)、松弛肽(rela)(in)一起被称为INS／IGF／relaxin家族蛋白。与哺乳动物相似,对鲑鳟鱼类的研究发现IGF-I mRNA在肝脏中含量最高,表明肝脏是IGFs主要的分泌表达场所。目前已发现有4种亚型的IGF-I mRNA,     

3种野鲮亚科鱼类线粒体细胞色素b基因序列分析及种质鉴定

鲮、麦瑞加拉鲮和露丝塔野鲮隶属鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）中的野鲮亚科（Labeoninae）.这三种鱼类种苗外形相似,仅凭形态上的差别难以区分,而在实际生产、种苗引进及苗种放流时需要进行严格的鉴定.本研究利用PCR-RFLP技术对鲮、麦瑞加拉鲮和露丝塔野鲮进行种苗鉴定的分析,并利用三种鱼类cyt b基因序列的差异进行亲缘关系分析.     

鲮β-肌动蛋白基因的分子克隆及其作为分子内标的可靠性分析

β-actin是actin家族的一员，在维持细胞结构、细胞内运动和细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的鲮（Cirrhinus molitorella）β-aetin基因的cDNA全长1 804bp，开放阅读框长1 128bp，编码375个氨基酸，5’和3’末端非翻译区域（UTR）分别为94bp和582bp。RT-PCR结果表明，β-actin在未经LPS刺激的和经LPS刺激的鲮心脏、肾脏、肌肉、肝脏、脾脏、肠、脑和皮肤等8种组织中广谱表达，表达水平没有明显差异，可以作为基因表达调控研究的分子内标。鲮与其他鱼类β-actin基因编码区核苷酸序列同源性在85.9％～99.6％。分子系统进化树分析表明，可将鱼类分成鲤形目，鲈形目，鲑形目和合鳃目4大支，与传统分类一致，β-actin基因核苷酸序列是研究分子进化的一个很好的分子标记。     

黄鳍棘鲷重组IL-1β的表达及生物学活性检测

将扩增得到的黄鳍棘鲷Acanthopagrus latus白细胞介素1β（Interleukin 1β,IL-1β）基因克隆到表达载体pQE30,并转化到大肠杆菌M15中进行表达。采用Ni^2＋-Chelating Sepharose FF层析对重组蛋白进行纯化,并用梯度透析对纯化蛋白进行复性。经SDS-PAGE和Western Blot分析,获得了分子量为21kD的重组白细胞介素1β（Recombinant Interleukin 1β,rIL-1β）。采用Percoll不连续密度梯度离心分离黄鳍棘鲷头肾白细胞,在分离液密度1．080g／ml的界面上可以有效富集白细胞。用不同终浓度的rlL-1β和5μg／ml脂多糖（LPS）刺激培养的黄鳍棘鲷头肾白细胞,23℃培养4h后提取细胞的总RNA,经RT-PCR半定量检测,当培养基中rIL-1β的浓度达到20ng／ml时可以提高IL-1β基因的转录水平,与5ug／ml LPS的刺激效果相当,表达的重组蛋白表现出很好的生物学活性。