养殖大菱鲆腹水病病原菌的分离与鉴定

[目的]从养殖大菱鲆中分离腹水病病原菌,并对其进行鉴定。[方法]从山东半岛2个不同的养殖场腹水病发病大菱鲆体内分离病原菌,并通过常规生理生化试验和16S r DNA基因序列对比对其进行鉴定。[结果]共分离到2株优势细菌。常规生理生化特征分析表明,这2株菌分别与鲨鱼弧菌(Vibrio carchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)表性特征非常相似。系统发育树分析表明这2株菌与鲨鱼弧菌(Vibrio carchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的亲缘关系最近。[结论]这2株细菌被鉴定为鲨鱼弧菌(Vibrio carchiariae)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)。     

基于vhhP2基因的SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌方法的建立

根据哈维氏弧菌(Vibro harveyi)溶血素基因vhhP2的保守序列设计特异性引物, 建立了SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌的方法。构建含vhhP2基因的重组质粒作为标准品, 进行SYBR Green I实时定量PCR, 在Tm为60℃时, 扩增产物的熔解曲线仅有一个特异峰, 扩增所得标准曲线为y= –3.331x+37.48, 相关系数为0.998, 扩增效率为1, 最低可检测到7个拷贝。实验结果表明该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性, 对哈维氏弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

     

三种植物精油对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的抑菌效果及其毒力基因表达的影响

为研究百里香精油、牛至精油和肉桂精油对海水养殖重要致病菌美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacterium damselae subsp．damselae,PDD）的抑菌作用,采用二倍稀释法分别测定3种植物精油对6株不同致病力PDD菌株的最小抑菌质量浓度（MIC）和最小杀菌质量浓度（MBC）。采用分光光度计法检测添加精油后6株PDD生长曲线的变化;以2株高致病性PDD菌株为研究对象,分析不同浓度精油对PDD毒力基因表达量及胞外产物（extracellular products,ECP）活性的影响;分析了3种精油存储不同时间后以及在金属离子影响下的药效稳定性。结果显示,这3种精油对6株PDD菌株均具有较好的抑菌及杀菌作用,MIC为32～128 μg/mL,MBC为64～192 μg/mL;3种精油对2株高致病性PDD菌株的毒力基因表达及ECP的磷脂酶活性和溶血活性均有抑制作用,其中低浓度精油对PDD主要毒力基因的抑制作用最明显。3种精油于室温下避光存储35 d,对实验菌株的杀菌率均大于99%,显示其良好的药物稳定性;水环境中不同浓度Na+、Mg2+、Ca2+、K+等对3种精油的杀菌效果无明显影响。研究表明,3种精油均适宜开发为防治水产动物细菌性疾病的新型渔药或饲料添加剂。本研究可为拓展芳香类植物精油在水产疾病防控上的应用提供借鉴与参考。     

凡纳滨对虾白便综合征发生与环境因子、机体免疫酶活性和微生物的相关性

为系统解析凡纳滨对虾白便综合征 (white feces syndrome,WFS)的发生与环境因子、微生物因子、宿主免疫力和水体微生物群落组成的关系。实验利用水体理化因子、可培养细菌、对虾机体免疫酶活性以及高通量测序等检测技术对健康与患WFS的池塘养殖凡纳滨对虾进行比较分析。结果显示,与健康组相比,患病池塘的水温、溶解氧 (DO)、pH、盐度等水质理化因子波动趋势相似,波动范围分别为26.1~29.0 °C、4.26~6.08 mg/L、8.39~8.73和40~49,患病组DO和盐度比健康组高;健康组对虾肝胰腺内可培养细菌和弧菌含量为1.19×10⁵~7.70×10⁵和8.8×10³~1.96×10⁴ CFU/g,弧菌占比为2%~16%,患病组对虾肝胰腺内可培养细菌和弧菌含量在3.80×10⁵~2.51×10⁶和2.02×10⁵~1.49×10⁶ CFU/g范围内,比健康组高15~113倍,弧菌占比在55%~70%。碱性磷酸酶 (AKP)、酸性磷酸酶 (ACP)、溶菌酶 (LZM)、超氧化物歧化酶 (SOD)和酚氧化酶 (PO)活性在健康组内为1.21~5.64、9.17~15.25、3.56~7.43、4.83~6.70及3.10~4.55 U/mg,在患病组内为2.12~5.39、19.22~26.96、19.73~26.85、3.00~4.14及7.76~9.21 U/mg。比较分析表明,WFS的发生与可培养细菌含量、弧菌占比、ACP、LZM、PO的相关性较强。高通量测序分析表明,患病组水体菌群结构的Ace和Chao指数呈一定程度下降趋势,PCoA指数偏离度较高,放线菌门、变形菌门相对丰度降低,拟杆菌门、蓝藻门相对丰度显著升高;RDA关联分析表明,盐度、溶解氧、虾体细菌、虾体弧菌、水体细菌是影响患病对虾水体菌群结构组成的重要因子。相关研究结果为解析养殖生产中对虾WFS发生机制提供数据支撑,并为WFS的临床防控奠定理论基础。     

花生磷利用效率及土壤盈余磷分布对不同耕作措施的响应特征

在农业生态系统中,提高作物对磷的吸收和利用效率是促进作物生长和节约养分资源的关键。为探究不同耕作措施下花生磷吸收效率及土壤盈余磷分布,在胶东半岛的莱西望城、招远夏甸和招远齐山三个试验点开展免耕、浅耕、深耕和深松四种土壤耕作措施下花生生产试验。结果表明,与免耕相比,深耕和浅耕提高了花生产量、磷吸收和磷利用效率。相同磷肥用量下,随着单产每增加1 000 kg/hm²,磷吸收量、磷肥回收率、磷肥偏生产力、磷肥耕作效率分别提高4.30 kg/kg、0.09 kg/kg、20.40 kg/kg和0.20 kg/kg,花生产量的提高和磷的吸收呈显著正相关。不同团聚体大小有效磷含量与土壤微生物组成有关,在大于2 000μm团聚体中有效磷含量随丛枝菌根真菌和腐生真菌的增加而增加,在53～250μm团聚体中细菌所占比例与团聚体有效磷含量呈显著正相关,在250～2 000μm团聚体中放线菌微生物种群占比与有效磷含量呈极显著正相关。上述研究表明,深耕和浅耕是改善花生田植株生长和磷吸收的较优耕作方式。     

刺参(Apostichopus japonicus)保苗期“肠炎病”及其治疗方法

对2014年3月山东省蓬莱某刺参(Apostichopus japonicus)保苗场患“肠炎病”的刺参进行了临床症状和组织病理学观察以及病原菌分离与鉴定,利用氟苯尼考为治疗药品,以脏壁比、增重率和特定生长率为评判指标,探讨了3种不同用药方式(口服、药浴、口服+药浴)对刺参保苗期“肠炎病”的治疗效果.结果显示,刺参“肠炎病”症状表现为体色发黑,附着能力弱,摄食和活动能力差,解剖后可见肠道内食物不连续,肠腔内有大量黄白色粘液或浓状物质,肠道壁变脆、韧性差且易断裂,显微镜下观察到肠道存在大量细菌;组织病理学显示,患病刺参肠道绒毛膜散乱、粘膜层溃散,结缔组织散乱,且与肌肉层分离较明显.自刺参肠道处分离出优势度最高的细菌In-1菌株,人工感染实验证实,该菌为刺参“肠炎病”致病菌,该致病菌主要来源于饲料藻粉.利用细菌形态观察、生理生化和分子生物学方法(16S rDNA和gyrB)鉴定该菌株为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi).该菌株对头孢三嗪、阿奇霉素、强力霉素和氟苯尼考等12种药物高度敏感.不同用药方式的治疗效果显示,使用氟苯尼考药浴可获得最佳治疗效果,刺参经药浴治疗后增重率达(24.23±0.41)％,特定生长率达(0.77±0.01)％/d.本研究可为刺参疾病防控和健康养殖提供理论依据和技术参考.     

槟榔、川楝子复方中草药对大黄鱼4种酶活性的影响及对刺激隐核虫的杀灭效果分析

海水小瓜虫病是养殖大黄鱼(Larimichthys crocea)和数十种海水鱼类较难控制的主要疾病,它是由刺激隐核虫(Cryptography irritans)感染引发,严重威胁鱼类养殖产业的健康发展。本研究利用复方中草药"HD-2"(槟榔、川楝子、绵马贯众、大青叶、穿心莲等以一定比例混合,超微粉碎经过200目过筛后收集粉末)投喂大黄鱼,研究大黄鱼溶菌酶(LZM)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)等非特异性免疫指标变化和不同用药方式对刺激隐核虫的杀灭效果。结果显示,口服"HD-2"可以促进鱼体LZM、T-SOD、AKP、ACP活性升高,以添加2%中草药组在提高4种酶活性方面作用显著,投喂后第14~21天酶活性最高。"HD-2"对体外刺激隐核虫幼虫的杀灭实验证实:4 h内在50 mg/L浓度下对幼虫没有杀伤作用,80 mg/L、100 mg/L、200 mg/L浓度分别可以杀死20%、54%、89%的幼虫,400 mg/L浓度下幼虫被全部杀死,幼虫4 h半致死浓度为109 mg/L。在室内为期15 d的大黄鱼小瓜虫病治疗实验中,A组按20 g/kg添加"HD-2"药物口服,同时按100 mg/L浓度药浴,存活率为50%;B组按20 g/kg添加药物口服,同时按50 mg/L浓度药浴,存活率50.67%;C组,在无药浴情况下,仅按20 g/kg添加药物口服,存活率为42.67%;A、B、C组存活率均显著高于对照组存活率2.67%(P0.05)。此外,A、B、C 3组中,大黄鱼胸鳍上白点数量明显少于对照组;同时,3个组的大黄鱼鳃丝上隐核虫数量均呈显著下降趋势(P0.05),实验结束时几乎观察不到虫体;而对照组大黄鱼鳃丝上隐核虫数量明显上升。实验过程中A、B、C 3组大黄鱼释放到体外的包囊数量明显下降,第12天时其包囊数量分别下降100%、91.1%、77.7%,与对照组差异极显著(P0.01)。综上所述,口服和药浴同时用药具有最佳效果,仅口服中草药亦能达到良好治疗效果。从实用性和成本考虑,建议仅进行口服处理,即能保障大黄鱼较高成活率,中草药添加量为2%,投喂时间为6~14 d。该结果为防控鱼类小瓜虫病提供了理论参考和技术支撑,在养殖生产中将具有良好的应用前景。     

津冀地区养殖三疣梭子蟹大量死亡的病原和病理分析

2014年7月,津冀沿海地区池塘养殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴发疾病,导致大量死亡。患病梭子蟹有两种不同表现症状:一种症状为停止摄食,空胃、空肠,行动迟缓;肌肉白浊、不透明,最后乳化呈牙膏状;该病死亡率达60%~70%,称之为"肌肉白浊病"。另一种症状为壳软,停止摄食,行动迟缓;肌肉变白浊、水样变化、萎缩;体腔液及组织坏死液化后从组织中大量渗出,不凝固;死亡率可达90%以上,称之为"牛奶病"。通过疾病流行特征、组织病理、病原超微结构等分析,初步判断肌肉白浊病由一种微孢子虫感染而致,虫体大小(1544±250)nm,呈椭球形,极丝圈数8~9圈,具孢壁[厚(130±22)nm],纤毛(长120~500 nm)、极体[(726±200)nm]、极管、固定盘、质膜、核等结构;牛奶病则是由一种血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)感染而致,虫体大小8~10μm,卵圆形,体表多皱褶、凸起,由细胞壁、多核、纤毛等组成。两种患病蟹的肌肉组织病变明显不同:患肌肉白浊病的蟹肌纤维断裂、溃散、浆质化,肌束减少并被团状集聚的寄生虫充斥、占据。电镜观察显示肌纤维细胞破碎、融合,出现大量空泡结构;肌纤维细胞的线粒体、内质网等细胞器解体、消失。患牛奶病的蟹肌束间隙变大,大量血卵涡鞭虫或充斥在间隙中或附着在肌纤维上,导致肌纤维断裂、离散解体,甚至溶解性坏死,组织呈水样变化。电镜观察也证实这两种寄生虫可同时感染三疣梭子蟹个体的同一组织;当肌纤维细胞破碎融合后,两种寄生虫均能寄生在融合后的胞浆中。从发病史来看,肌肉白浊病和牛奶病的发生有蔓延趋势,死亡率趋向更高,已逐步成为三疣梭子蟹养殖的重要疾病。     

刺激隐核虫对大黄鱼致病力及中草药抑制其世代繁殖的研究

由刺激隐核虫寄生感染而引起的"白点病"成为大黄鱼养殖生产中危害最为严重的病害之一。为研究刺激隐核虫对大黄鱼的致病力及复方中草药HD-2对刺激隐核虫世代繁殖的抑制和阻断其感染的效果,本研究在测定了患病大黄鱼产生刺激隐核虫包囊数量、大小、孵化率和幼虫产率的基础上,测定了幼虫体外存活时间和感染力。同时,研究了HD-2中草药液对刺激隐核虫幼虫、滋养体和包囊的杀除效果以及口服复方中草药HD-2对患病大黄鱼的治疗效果。结果显示,自然患病大黄鱼体型规格与产生包囊总数呈正相关,包囊直径为(340.8±64.9)μm,平均孵化率为76.4%,每个包囊可产生280±42.5个幼虫;幼虫体外最长存活时间超过24 h,幼虫孵化20 h后便丧失感染力。幼虫感染大黄鱼7 d的LD_(90)为9 712个幼虫/尾,LD_(50)为4 366个幼虫/尾。HD-2中草药液可有效杀灭刺激隐核虫幼虫,分别口服含复方中草药5、10和15 g/kg饲料30 d的实验组大黄鱼在LD50攻毒剂量下其相对感染强度较对照组分别下降32.0%、44.5%和51.8%,包囊体积较对照组分别减少35.4%、36.1%和37.3%,孵化率分别下降16.3%、23.3%和27.9%;在LD90攻毒剂量下3个实验组大黄鱼的存活率分别达到40.0%、55.0%和58.3%,显著高于对照组(8.3%),且鳃丝、胸鳍上滋养体数量较对照组显著下降。口服复方中草药HD-2对自然患病大黄鱼的治疗效果表明,采集口服15 d的3组大黄鱼的包囊数量分别较对照组下降73.1%、87.7%和93.8%,鱼体死亡率分别为58.3%、36.7%和21.7%,较对照组83.3%的死亡率明显降低,且用药组大黄鱼的生理状态明显优于对照组。由此可见,口服复方中草药HD-2能有效阻断刺激隐核虫的二次感染,抑制包囊的形成和发育,降低包囊孵化率和幼虫孵化数量,从而有效抑制了虫体的世代繁殖。     

土壤崩解速率的一种修正方法

为了获得更为准确的土壤崩解速率测定及计算方法,以便客观评价土壤侵蚀程度,借助子洲县坡耕地原状土壤样品,通过土块在水中受力分析,对比了拉力计方法和修正拉力计方法计算的土壤崩解速率结果。结果表明,拉力计方法测定土壤崩解速率中土壤自身含水量对崩解过程有重要的影响。修正拉力计算法所得的土壤崩解速率与已有报道更为吻合,其变异性较未修正前有所减小。因此,建议在土壤崩解速率测定和计算应按以下步骤:（1）利用方形环刀在野外取原状土样并用塑料薄膜密封;（2）将土样带回实验室称重,垫上滤纸,用浅层水盘自下而上浸润土壤,直至土壤饱和;（3）将饱和的土样放置在一铁架台上去除重力水后再次称重;（4）轻轻移开方形环刀,将土样放置在拉力计的吊盘网板上测定;（5）计算需乘以校正系数k。