鸡新城疫病毒分子生物学特性及检测方法研究进展

鸡新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性败血性传染病,是危害养鸡业发展最严重的疫病之一.NDV属于副黏病毒科、副黏病毒亚科、腮腺炎病毒属,是一种有囊膜的负链RNA病毒[1].     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白的免疫原性评估

为了评估猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白的免疫原性,利用果蝇胚胎S2细胞表达重组S1蛋白,将纯化的S1蛋白免疫4周龄昆明小鼠,收集免疫血清及脾淋巴细胞,通过ELISA、病毒中和试验和流式细胞术等方法分析表达的重组S1蛋白的免疫原性。结果显示,与对照组(PBS)相比,重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体水平显著提升;二免后14 d,果蝇细胞重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠的中和抗体效价达到1∶320;免疫后小鼠脾脏淋巴细胞具有更强的增殖能力;外周血CD3⁺T细胞百分比显著增加,CD4⁺/CD8⁺T细胞比值高于对照组;小鼠血清中IL-4、IFN-γ水平显著上升。综上,成功表达了重组PEDV S1蛋白,其可以诱导小鼠产生高效价的中和抗体,促进细胞免疫应答。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株的分离鉴定

对河南漯河地区某养殖场检出的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性病料进行处理,接种到原代猪肺泡巨噬细胞中,经细胞盲传成功分离出1株PRRSV毒株,命名为HeNLH2017株,并测定了该分离株在原代猪肺泡巨噬细胞上的生长曲线。为进一步分析该分离株的遗传进化特点,扩增测定了ORF5基因和部分Nsp2基因的核酸序列。核酸同源性分析显示,该分离毒株ORF5基因和Nsp2序列与NADC30毒株同源性最高,分别为93.4%和93.8%。遗传进化树分析显示,该分离株与我国2013年以来流行的NADC30-like(Lineage1)毒株处于同一进化分支。氨基酸序列比对分析显示,ORF5基因和Nsp2序列与NADC30-like毒株具有相似的遗传变异特点,且Nsp2序列存在特征性的131个不连续的氨基酸缺失。成功分离到1株NADC30-like毒株,有助于进一步认识NADC30-like毒株在河南地区的流行情况和临床致病特点。     

鸡传染性法氏囊病快速诊断试纸条的研制及特性测定

以高亲和力和高特异性IBDV单克隆抗体为基础,成功的研制出IBDV快速诊断试纸条,试验结果表明IBD试纸与鸡的NDV、ALV、EDS-76、IBV、ILTV、MDV无交叉反应。IBD试纸条具有良好的特异性和敏感性,其敏感性与琼扩试验相比,则提高了32—64倍,能够识别不同的IBDV毒株包括强毒和弱毒。与ELISA的阳性符合率为100％。对于人工感染IBDV鸡,感染后36h在感染鸡的法氏囊即可检出IBDV,从检测到获得结果仅需要1-2min,IBD试纸具有特异、敏感、快速、简单等特点,不需要任何专业技能和其他试剂,实现了鸡病诊断的一步法。     

兽用抗菌药盐酸二氟沙星的研究及其残留检测

二氟沙星（Difloxacin）又名双氟哌酸,是抗生素喹诺酮（Quinolone）类化合物第三代产品——动物专用氟喹诺酮类药物之一。最早是由美国Abbott公司于1984年研制而成,盐酸二氟沙星是其盐酸盐。由于本品具有广谱、高效、低毒等特点,现在已进人欧洲大部分国家的兽药市场,我国也于1999年10月批准生产（农牧发[1999]20号）。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

甲基-CpG结合结构域蛋白2抑制PRRSV复制的研究

为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2 (MBD2)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36、48 h后分别取样,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blots试验进行检测。结果表明,PRRSV感染下调MBD2的mRNA和蛋白的表达水平。用真核表达载体pc DNA 3.1-Flag构建了MBD2的真核表达质粒pc DNA3. 1-Flag-MBD2,用pc DNA3. 1-Flag-MBD2转染MARC-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后收获细胞。TCID50的试验结果表明,过表达MBD2能降低PRRSV滴度,而qRTPCR和Western blots的结果则表明MBD2能降低PRRSV的载量;相反,MBD2的siRNA试验表明,下调表达有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。通过基因缺失试验,构建MBD2部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制起关键的作用。研究结果表明,MBD2是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。     

环丙沙星完全抗原的制备和间接竞争ELISA检测方法的初步研究

为了研究检测环丙沙星(CIP)残留的间接竞争ELISA方法,试验采用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)一步法将环丙沙星分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫原(CIP-BSA)和包被原(CIP-OVA),用免疫原免疫Balb/c小鼠制备血清多克隆抗体(CIP pAb...     

禽腺病毒4型XZ株增殖与纯化方法的建立

2015年7月以来,禽腺病毒4型在中国的大部分地区暴发流行,并造成重大损失。为进一步对该病毒进行研究,采用两种方法对所分离的XZ株进行体外增殖培养,并利用透射电镜观察到完整的病毒粒子,同时采用超滤浓缩和凝胶层析的方法对病毒进行纯化。结果显示,成功建立了稳定的禽腺病毒4型XZ株增殖体系,以及温和、高效的病毒纯化工艺,且纯化病毒感染性强,具有很好的免疫原性。