多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎和赤羽病方法的建立和应用

为满足同时对IBRV和AKAV进行快速诊断的需要,根据牛疱疹病毒1型(BHV 1)gB基因序列和赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:该方法能同时扩增得到2条与试验设计相符的311 bp(I BRV)和392 bp(AKAV)特异性条带;IBRV的灵敏度为0.13 pg/25μL,AKAV的灵敏度为1.04 pg/25μL。本试验方法的建立对于加强进出口牛IBRV和AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。     

进口奶牛病毒性腹泻病毒快速检测鉴定

采用ELISA方法对3 073头奶牛全血进行牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)检测,结果发现编号a889的血样呈阳性反应,另外有3份血样(a126、a803、b1277)呈可疑反应;进一步的白细胞抽提物ELISA反应表明,a889血样呈阳性反应,其余呈阴性反应。对a889血样进行RT-PCR扩增,得到1条310 bp大小的特异性条带,与预期片段大小吻合;经序列同源性比较分析,确定a889血样中存在牛病毒性腹泻病毒。     

吸附ELISA检测奶牛副结核病

应用吸附ELISA对2批澳大利亚及1批新西兰进口奶牛进行副结核病的检测,结果2头阳性反应,其余为阴性反应。特异性试验和重复性试验表明吸附ELISA在进口奶牛副结核病的检测中,结果准确、特异性高、重复性好,且具有快速、灵敏、操作简单的特点,适合应用于大批量样品副结核病的检测。     

阻断酶联免疫吸附试验检测赤羽病

赤羽病(Akabanedisease)又称阿卡斑病,是牛、羊的一种以流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊、新生胎儿发生关节弯曲积水性无脑综合症为特征的病毒性传染病。本病的病原赤羽病病毒是布尼安病毒科(Bunvaviridae)、辛波(Simbu)病毒群的成员之一。最早在澳大利亚暴发,后在日本、美国、韩国等国也分离到该病毒。本病的流行对养牛、养羊业的发展构成巨大的威胁,因此该病是我国从澳大利亚进口奶牛必须检测的七种疫病之一。     

逆转录环介导等温扩增技术检测烟草环斑病毒的研究

 本研究采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),建立了一种快速、简便的烟草环斑病毒检测方法。根据TRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的梯度条带。特异性试验表明,引物对TRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比普通RT-PCR高10倍。通过反应温度和时间的优化,该方法只需在水浴锅中60℃等温扩增60 min,整个检测周期约1.5 h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。     

检测小麦线条花叶病毒的TaqMan MGB探针技术

为给小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,WSMV)的灵敏、稳定、快速检测提供依据,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了WSMV的实时荧光RT-PCR检测方法.结果表明,本研究设计的TaqMan MGB荧光探针对WSMV的检测具有很好的特异性,解决了因病毒不同分离物之间基因组变异较大、难以找到长片段保守序列来设计探针的困难.该方法无需任何PCR后处理.基因污染风险小.它与双抗体夹心酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高1 000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合于WSMV的快速检测.     

嗜水气单胞菌生物被膜的特性与相关基因的研究

建立嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）的生物被膜（BF）体外形成模型,用银染法及扫描电镜观察检测Ah致病株J-1、N-1及非致病株W-1、4332株产生BF的情况,同时研究温度和消毒剂对AhJ-1株的游离（Fc）细菌（以下简称FC细菌）和具有BF的细菌（以下简称BF细菌）的影响。实验表明：致病株AhJ-1、N-1株均可形成BF,而非致病株Ah W-1、4332株均不形成BF。Ah J-1株的BF细菌经85℃ 30min、-20℃ 80d、0．01％新洁尔灭处理后均有存活,而FC细菌无存活细菌。根据已发表的Ah A1株的转录调节蛋白基因（AhyR）核苷酸序列,设计并合成了一对引物,对AhJ-1、N-1、W-1、4332株的基因组进行PCR扩增和测序分析。发现致病性AhJ-1、N-1株可扩增出912bp的核苷酸片段,该片段与已发表的AhAhyR基因的同源性达99％．而非致病性AhW-1、4332株无该基因片段。     

环介导等温扩增技术检测油棕猝倒病菌的研究

油棕猝倒病菌是我国进境植物检疫性有害生物。试验应用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了一种快速敏感的油棕猝倒病菌检测方法。根据ITS区基因上的8个位点,共设计了6条引物,并对反应条件和反应体系进行优化。特异性试验结果表明,引物对油棕猝倒病菌的检测具有良好的特异性;灵敏度试验结果表明引物最低检出限为0。12 ng·μL-1比普通PCR高100倍;检测结果经SYBR Green Ⅰ染色后,肉眼即可观察结果。该方法能够快速、灵敏、特异地检测油棕猝倒病菌,只需一台水浴锅就可以开展检测,非常适合基层现场检测。     

嗜水气单胞菌生物被膜的特性与相关基因的研究

建立嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)的生物被膜(BF)体外形成模型,用银染法及扫描电镜观察检测Ah致病株J-1、N-1及非致病株W-1、4332株产生BF的情况,同时研究温度和消毒剂对Ah J-1株的游离(FC)细菌(以下简称FC细菌)和具有BF的细菌(以下简称BF细菌)的影响.实验表明:致病株Ah J-1、N-1株均可形成BF,而非致病株Ah W-1、4332株均不形成BF.Ah J-1株的BF细菌经85℃30 min、-20℃80 d、0.01%新洁尔灭处理后均有存活,而FC细菌无存活细菌.根据已发表的Ah A1株的转录调节蛋白基因(AhyR)核苷酸序列,设计并合成了一对引物,对Ah J-1、N-1、W-1、4332株的基因组进行PCR扩增和测序分析.发现致病性Ah J-1、N-1株可扩增出912 bp的核苷酸片段,该片段与已发表的Ah AhyR基因的同源性达99%,而非致病性Ah W-1、4332株无该基因片段.