褐飞虱神经肽及其受体基因的功能筛查

神经肽对昆虫的生命活动和环境适应性具有重要影响,是害虫防治的潜在靶标。褐飞虱（Nilaparvata lugens）是亚洲地区一种重要的水稻害虫。本研究对褐飞虱神经肽及其受体基因的功能进行了筛查,通过聚合酶链反应扩增并验证得到了41个神经肽基因（含1个可变剪接本）和44个受体基因。通过RNA干扰方法,得到沉默后造成高死亡率的4个神经肽基因（NlCCAP、NlETH、NlOKA和NlPK）和2个受体基因（Nl A36和NlA46）,这些基因在褐飞虱3龄若虫阶段注射双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)进行沉默后,成虫相对存活率<0.2,具有成为害虫防治靶标的潜力。RNA干扰结果表明：几种蜕皮前后行为调控神经肽,如甲壳类动心肽、蜕皮诱导激素、鞣化激素的基因与其他昆虫研究中报道的功能相似,而另一些与蜕皮调控相关的神经肽（如促前胸腺激素、羽化激素）在褐飞虱中的生理功能则不明显。本研究为褐飞虱神经肽生理功能的深入探索奠定了基础。     

茶刺蛾核型多角体病毒与其它杆状病毒关系的基因分析

茶刺蛾核型多角体病毒IragoidesfasciataNucleopolyhedrovirus(IrfaNPV)是新分离的一种杆状病毒。本研究克隆和分析了IrfaNPV的AcORF47同源基因和VP80基因。AcORF47同源基因与苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenucleocapsidnucleopolyhedrovirus,MNPV,AcMNPV)的ORF47和家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)的ORF38有42%的同源性,与薄荷灰夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(Rachiplusiaoumultiplenucleocapsidnucleopolyhedrovirus,RaouMNPV)的ORF44有40%的同源性。IrfaNPV的VP80C端222氨基酸与17种NPV特有结构蛋白VP80/P87有25%~58%同源性。在18种VP80/P87分子进化树上,IrfaNPV与AcMNPV、BmNPV和RaouMNPV的亲源关系最为接近。     

浅论昆虫产业开发

昆虫是目前地球上最大的尚未被人们充分利用的资源，基于这一认识，本文扼要综述了国内外昆虫产业的产业类别和技术开发近况，并就通向成功与繁荣的道路作了讨论。     

棉铃虫核型多角体病毒ORF27基因的表达和细胞内定位

棉铃虫核型多角体病毒（HaSNPV）ORF27编码区全长768bp，编码255个氨基酸残基组成的多肽，预计分子量29.5kD。PCR扩增获得该基因，克隆到融合表达载体pGEX-4t-2中，表达蛋白分子量55.5kD，表达量约占细菌总蛋白的9.2%。割胶透析法纯化融合蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体。再把该基因插入到转移载体pFastBacHTb，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，构建重组病毒；提取病毒基因组DNA，在Lipofectin介导下转染昆虫细胞Tn-5B1-4。表达蛋白分子量为32kD，表达量约占细胞总蛋白的2.9%。将ORF27在昆虫细胞中表达产物固定，免疫电镜法确定表达蛋白主要存在于细胞的细胞质中。ORF27基因表达及在细胞内定位为其进一步研究提供了基础。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2基因的克隆与序列分析

从中华蜜蜂（Apis cerana cerana)和意大利蜜蜂（Apis mellifera)工蜂毒腺中快速抽提总RNA，用RT-PCR方法分别扩增各得到约含470bp的cDNA片段，将这2个片段克隆入PGEM-T载体，进行测序和序列分析，结果表明，这2个片段均含有405bp、编码蜂毒PLA2成熟肽的cDNA，并分别由cDNA推导出两者所编码的氨基酸序列，经序列比较，中蜂PLA2与意蜂PLA2具有95%的同源性，与大蜜蜂PLA2、美国熊蜂PLA2及黑腹果蝇PLA2的同源性分别为90%、54%、39%。     

BmNPV的PK基因和杆状病毒PK基因的进化分析

家蚕核型多角体病毒镇江株（BmNPVZJ8）蛋白激酶（BmvPK－1）基因编码区含828个核苷酸，可编码推测分子量为32kD的多肽。应用GCG程序分析表明BmvPK－1与AcMNPV的PK－1相似性最高，两者氨基酸序列相似性达95.2％。比较同时表明，BmvPK-1氨基酸序列与其它生物Ser／ThrPK的催化结构域有很高的同源性，与人的HSPKCE，果蝇的dPKC98F和酵母的TPK1的催化结构域分别有31．1％、32．3％和31.2％的相似性。在PK的进化树中，杆状病毒PK是一独立进化的分枝，BmvPK-1与PK－1进化距离最近，而HavPK则与HzSNPV的PK距离最近。     

三种ALS抑制剂对四类植物ALS的抑制差异

用乙酰乳酸合成酶(ALS)活性测定方法研究了双草醚、KIH-15127、苄嘧磺隆3种ALS抑制剂对水稻、稗草和油菜ALS活性的抑制差异性。体外测定结果表明，不同植物ALS对双草醚和KIH-15127的敏感性差异较大，粳稻、稗草和油菜ALS的敏感性强于籼稻，而这些植物ALS对苄嘧磺隆的敏感性差异很小。体内结果显示，双草醚和KIH-15127对稗草和油菜ALS的抑制作用较强，对粳稻ALS的抑制作用可以恢复；苄嘧磺隆对油菜ALS的抑制作用也较强，但对稗草、水稻ALS基本无抑制作用；3种ALS抑制剂对籼稻ALS抑制作用均较弱。结果表明，不同植物对ALS抑制剂的敏感性存在差异。     

棉铃虫核型多角体病毒(HaSNPV)ORF99基因在昆虫细胞中的表达及亚细胞定位

棉铃虫核型多角体病毒ORF99 基因Ha99是其基因组中特有的一个基因,序列分析发现Ha99基因开放阅读框包含354 bp核苷酸,编码118个氨基酸残基,预测相对分子质量为13 kDa.Ha99基因进一步在Bac-to-Bac系统中进行表达,SDS-PAGE和Western blot分析显示Ha99基因得到了成功表达,表达的相对分子质量为13 kDa,与预测的大小相符.亚细胞定位分析表明,ORF99基因的表达产物主要定位在细胞质中.时序表达分析显示Ha99基因在病毒侵染后6 h开始表达,一直持续到侵染后122 h,表明Ha99基因是一个晚期表达的基因.     

中华蜜蜂MRJP7基因的原核表达及多克隆抗体的制备

用PCR方法从含中华蜜蜂Accmrjp7基因的质粒DNA模板中扩增出MRJP7成熟肽编码区片段,将该片段克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中进行融合表达,SDS—PAGE和薄层扫描显示,该基因得到高效表达,表达产物大小约为66kDa,占细胞总蛋白的22．8％。利用割胶回收的方法,获得目的蛋白,注射兔子制备多克隆抗体,并利用所获抗体进行Western blot印迹分析,检测MRJPs,获得特异性条带。     

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)实时荧光定量PCR检测方法的优化及应用

选用茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)基因组中序列特异性很高的p16基因为目标基因,通过设计引物、PCR扩增、目的片段与载体连接转化获得含p16基因的重组质粒进行测序,进而以经测序鉴定的p16基因的PCR纯化产物作为实时荧光定量PCR标准品模板,稀释后建立SYBR Green I荧光定量标准曲线,统计分析显示标准品浓度的对数值与Ct值之间存在良好的线性关系(R2=0.9981)。该方法的检测灵敏度为102,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间变异系数均小于3%。同时分别对含有其他茶树害虫病毒和不同浓度的茶尺蠖病毒产品的样品进行检测,能明确样品中是否含有EoNPV及含量。根据已建立的方法对感染病毒后不同时间段的茶尺蠖幼虫进行检测,每克幼虫样本内p16基因拷贝数的增殖倍数对数值与感染时间呈正相关(R2=0.9935),可以获得茶尺蠖幼虫感染病毒后不同时间的增殖动态。上述结果表明,该方法能定性定量鉴定茶尺蠖核型多角体病毒,可用于茶尺蠖核型多角体病毒类生物农药的检测和感染过程检测。