新型反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立

对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复性好的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与牛病毒性腹泻病毒及其他猪源病毒发生非特异反应。应用本试验建立的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法可以及早对猪瘟作出准确诊断,并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来,减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。     

IBDV山东地方株的分离鉴定与B87疫苗免疫保护效果研究

鸡传染性法氏囊病(IBDV)是一种危害雏鸡的免疫抑制性传染病.近年来该病在山东部分地区不断发生,损失较大.本试验取部分发病鸡,采集病料,通过琼脂扩散试验、PCR检测IBDV VP2高变区基因序列等检测方法分离鉴定了一株IBDV地方株,并测定了其致病性.结果表明该毒株有较高的致病性.疫苗接种试验表明,利用B87疫苗能较好地保护杂交鸡对于该毒株的攻击,表明选择合适的免疫程序和疫苗,可以较好地预防该病的发生.     

2型猪链球菌对四环素的耐药机制

采用微量稀释法测定36株2型猪链球菌对四环素的耐药性,应用PCR扩增四环素相关耐药基因tet（M）、tet（O）、tet（K）、tet（L）、tet（Q）、tet（S）、tet（T）和tet（W）,将扩增到的耐药基因克隆、测序,并进行序列分析。结果显示,36株2型猪链球菌对四环素的耐药率为100%,MIC90高于512mg/L;其中29株扩增出tet（M）基因,6株扩增出tet（O）基因,5株同时扩增到tet（M）、tet（L）基因,同时扩增到tet（M）、tet（L）基因的菌株MIC均高于512mg/L;同源性分析结果显示,扩增到的tet（M）基因与GenBank中已公布序列的同源性为95%～100%,tet（O）基因与GenBank中已公布序列的同源性为95%～99%。结果表明,我国大部分地区的2型猪链球菌对四环素均具有很强的耐药性,主要耐药机制是由tet（M）基因介导的核糖体保护作用。     

IBDV不同代次细胞毒免疫保护作用研究

一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)野毒经鸡胚传代，然后转为细胞培养，取第20代、21代、25代毒，以1倍量(3000 TCID50／0．2m1)和5倍量不同的免疫剂量，分别在1周龄、2周龄对商品代海蓝褐蛋鸡进行免疫，并于免疫前用IBD-ELISA试剂盒检测IBDV母源抗体水平，于5周龄用IBDV超强毒(vvIBDV)GX8／99攻毒，攻毒后观察记录各组鸡的致病率和死亡率。结果在2周龄免疫21代毒、25代毒，均可提供100％的保护。     

兔出血症病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立兔出血症病毒(RHDV)的血清学检测方法,本实验通过生物信息学分析,将RHDV衣壳蛋白VP60的3个区域VP60-1(aa2-aa208)、VP60-2(aa174-aa425)和VP60-3(aa342-aa579)分别进行原核表达,获得了大小为42 ku、47.5 ku和45.6 ku的重组蛋白。经ELISA和western blot试验分析显示3种重组蛋白均能够被RHDV阳性血清识别,但VP60-1较VP60-2和VP60-3具有更好的反应原性,因此以表达的重组蛋白VP60-1作为包被抗原建立了RHDV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,对不同免疫期兔血清的检测结果与HI呈显著相关性。对临床样品的检测结果表明该ELISA方法比HI试验更敏感。本研究以VP60-1为包被抗原建立的ELISA方法可以用于RHDV疫苗的免疫评估。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT—PCR检测方法的建立

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒（DHV-I）的基因序列,应用Primer Premier5．0软件设计了一对引物,建立了适合DHV—I快速检测的RT—PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT—PCR扩增,得到了预期大小为699bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的DHV-I的相应基因序列比对分析,同源性均达90％以上．表明为DHV—I的基因序列,对NDV,IBDV,DPV和GPV等常见病毒扩增结果为阴性。该方法敏感性检测结果表明．最低RNA模板检出量为24pg。表明所建立的RT—PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的快速诊断。     

兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及耐药基因检测

本试验旨在了解近年来浙江省兔支气管败血波氏杆菌的感染情况及耐药状况,指导合理用药,检测细菌的耐药基因,探究其耐药机理.根据细菌形态、培养特性、生化试验,结合PCR法对分离菌株进行鉴定;K-B纸片扩散法检测细菌对18种常用抗生素的耐药率;设计耐药基因特异性引物,PCR法扩增耐药基因,并进行测序分析.结果显示,分离鉴定出2012-2014年22株兔支气管败血波氏杆菌;药敏结果显示,分离菌对青霉素G、头孢拉定、链霉素、林可霉素、克林霉素、甲氧嘧啶耐药严重,对多黏菌素B、左氟沙星、强力霉素、四环素等药物敏感,耐β-内酰胺类药物的细菌中检测到耐药基因bla_TEM.结果表明,兔支气管败血波氏杆菌是引起兔呼吸道疾病的主要病原菌,分离菌多重耐药,耐药率较高,检测到的耐药基因与耐药表型相符.     

产肠毒素性大肠杆菌F41与987P菌毛蛋白的串联表达

根据GenBank中发表的E．coliF41、987P基因序列,分别设计合成一对引物。利用PCR技术．分别以大肠杆菌C83707的基因组和C83710的质粒为模板扩增F41、987P基因。通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切、连接和转化,构建了含F41-987P串联表达载体的重组菌株BL21（DE3）／pETF41-987P。经酶切、PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETF41-987P中含有F41-987P融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经过SDS．PAGE分析,串联表达蛋白含量在30％左右,经Western blot检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌F41、987P阳性血清识别。反向间接血凝试验结果,F41效价为2^6～2^8,987P效价为2^8～2^10。说明F41-987P融合蛋白具有良好的抗原性。表明构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株。     

鸡传染性支气管炎病毒分离株与疫苗株抗原相关性和S1基因序列分析

本实验挑选8株近年来山东省IBV分离株与疫苗株H120和491,利用SPF鸡分别制备了高免阳性血清,进行鸡胚交叉中和试验,计算其抗原相关系数,鉴定其血清型,并结合S1基因序列分析,研究其血清型和基因型之间的关系.结果显示:SDWF0608、SDLY0612、SDLY0701与疫苗株H120同属Mass血清型的不同亚型,其它5个分离株与H120和491不属于同一个血清型.结合S1基因序列分析发现,S1基因序列分析与血清中和结果二者不具有明显的相关性,8个分离株分属三个基因群,其中SDTA06111与H120等同属一个基因群,但血清中和实验显示它们不属于一个血清型;CK/CH/SD09/005与一个参考株独自构成一个基因群,其S1基因变异程度较大,并且能够与两个疫苗株发生交叉中和实验,但不属于一个血清型,它可能是一个基因重组后病毒.     

猪细小病毒VP2的原核表达及间接ELISA方法的建立

含有猪细小病毒结果蛋白VP2基因的重组质粒pET32c-VP2,转入表达宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,重组VP2蛋白高效表达,以包涵体形式存在,经变、复性和纯化后,Western blot显示有良好的生物活性。纯化后的重组蛋白作为抗原,包被酶标板,建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为3.1μg/mL;血清最佳稀释度为1∶100,阳性标准初步定为OD待检血清≥0.4且OD待检血清/OD标准阴性值≥2.1。