副结核分枝杆菌MAP1588C蛋白的原核表达与抗原性分析

从副结核分支杆菌K-10菌株基因组中扩增出516 bp的MAP1588C基因片段,插入原核表达载体pET-28b(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3),在0.5 mmol/L的IPTG诱导下进行表达;利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白;通过抗6 His标签抗体的Western blot验证了纯化蛋白产物;另外,副结核阳性牛血清可检测到该蛋白条带。结果表明,表达的重组蛋白MAP1588C的蛋白分子量为21 kDa,具有良好抗原性,有望将此抗原用于建立副结核的ELISA诊断方法。     

猪传染性胸膜肺炎PCR诊断方法的建立

根据已发表的猪胸膜肺炎放线杆菌APXIV毒素的基因序列，自行设计和合成了二对可扩增448bp和365bp目的片段的引物，成功的建立了检测APP的套式PCR方法。通过对猪肺疫巴氏杆菌、猪链球菌、大肠杆菌、猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体和猪丹毒杆菌的DNA进行了PCR检测，结果均为阴性；对猪胸膜肺炎放线杆菌的1、2、5、6、7、9国际标准血清型均扩增出448bp和365bp的特异性条带；检测的敏感度一步PCR可达到5OO个细菌，最低检出DNA浓度可达到0．585ng／mL；套式PCR可达到50个细菌，最低检出DNA浓度可达到58．5pg／mL。另外，对5株从病猪体内分离的猪胸膜肺炎放线杆菌进行了检测，5株均成阳性反应；对10只屠宰猪的肺脏分离物进行了检测，结果1份为阳性。结果表明此法特异性和敏感性均很高，可做为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断和流行病学调查的手段。     

猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白单抗的制备及其抗原表位的初步分析

应用大肠杆菌表达的猪瘟病毒主要保护性 E2抗原决定簇蛋白和全长 E2基因构建的 DNA疫苗免疫 BAL B/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与 SP2 /0骨髓瘤细胞进行融合 ,经克隆和间接 EL ISA筛选 ,获得了 A11、B2、E3、H6、D5、D86株稳定分泌抗猪瘟病毒 E2蛋白单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞株。它们的腹水效价在 1∶ 80 0～ 1∶ 2 10 0 0 0之间。抗体类型鉴定结果表明 ,A11、E3、H6、D5和 D8为 Ig M类型 ,B2为 Ig G类型。随后用蛋白 A凝胶层析法和 PEG沉淀法分别纯化了 Ig G和 Ig M单抗。对纯化单抗进行的抗原识别表位研究结果初步表明 ,6株单抗可能识别 3种不同的E2抗原表位。     

牛结核病研究进展

牛结核病(bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)所引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病,可通过病畜传染给人类或其他动物。牛结核病在世界各国均有发生,在我国依然是最常见的多发性疾病,牛结核病有众多的宿主谱,几乎可以感染所有的温血脊椎动物。牛结核病的传染流行严重地影响到畜牧业的持续健康发展,不仅造成奶牛乳房炎、结核性胸膜炎等疾病,还造成牛奶产乳率和乳质下降,更严重威胁着人类的身心健康。     

牛分枝杆菌分枝菌酸环丙烷合酶PCAA的表达与鉴定

以牛分枝杆菌Vallee株基因组为模板,利用PCR方法扩增该菌株的环丙烷一分枝茵酸合酶pcaA基因,并克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,通过大肠杆菌BL21（DE3）表达重组融合蛋白,并利用Ni-亲和层析的方法纯化出重组蛋白。通过鉴定其免疫活性。试验结果表明,成功扩增出了牛分枝杆菌中pcaA基因并纯化出了重组的融合蛋白,通过免疫印记发现,重组蛋白可与牛结核阳性血清发生特异性反应,为进一步研究牛分枝杆菌的致病机理奠定基础。     

利用CRISPR/Cas12a技术快速检测胸膜肺炎放线杆菌方法的建立

为建立可用于临床检测猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法,本研究根据App apxIVA基因3'末端保守区,设计CRISPR/Cas12a特异性gRNA,在gRNA序列与靶序列结合位点的上下游区域内,利用Primer Premier 5.0设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物,利用RPA引物扩增靶基因apxIVA,通过gR...     

直接从粪便中提取副结核分枝杆菌DNA的方法及其应用

分枝杆菌病是严重危害畜禽的主要传染病。长期以来,对该病的诊断一直是人们感到棘手的问题,由于分枝杆菌之间存在许多共同抗原,故使常规的诊断方法均存在着假阳性和敏感性不高的缺点。为此,急需寻求一种特导的诊断方法。核酸探针诊断技术是近年     

牛结核病新型疫苗的研究现状

在过去的20年里,人们应用分子生物学技术来研制更为有效的结核病疫苗,新型候选疫苗大量涌现。这些新型疫苗主要包括减毒活疫苗、重组活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗。对防制牛结核病的各种新型疫苗也进行了相应的研究,并取得了令人振奋的进展。各种新型疫苗各有优缺点。目前看来,重组卡介苗和DNA疫苗被认为是最有前途的候选疫苗。但是,所有候选疫苗共同的也是致命的缺点是免疫保护力低。因此,牛结核病疫苗研制的主要努力方向还是在研究分支杆菌免疫机制和免疫失败原因的基础上,进一步增强现有候选疫苗的免疫效力或研制更为有效的新型疫苗。     

牛分枝杆菌与鸟型分枝杆菌2型重组蛋白Ag85b的血清学交叉反应研究

牛分枝杆菌(M.bovis)是引起牛结核病的常见病原,而鸟分枝杆菌(M.avium)2型则通常交叉感染牛,但不会导致严重的病变.为鉴定M.bovis和M.avium的免疫交叉反应情况,本研究分别以M.bovis和M.avium 2型的基因组为模板,扩增ag85b基因,分别构建了M.bovis和M.avium的原核和真核表达重组质粒进行表达.以原核表达纯化的两种重组蛋白Ag85b (rAg85b)分别作为包被抗原,交叉检测两种真核重组质粒免疫豚鼠制备的抗血清.结果表明,原核表达的M.bovis和M.avium rAg85b与真核重组质粒免疫豚鼠制备的两种抗血清之间存在较强的免疫交叉反应.研究结果揭示M.bovis和M.avium的Ag85b蛋白存在很强的血清学交叉反应,这将严重干扰M.bovis Ag85b作为候选疫苗的免疫监测.     

结核分枝杆菌Rv1400c多抗制备及反应原性分析

将pET28b-Rv1400c重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,筛选出阳性菌株并增菌培养后IPTG诱导表达,离心后沉淀用SKL变性溶解,用亲和层吸树脂纯化Rv1400c蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白表达与纯化情况;利用Rv1400c蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;Western-blot分析鹿结核阳性血清的反应情况。SDS-PAGE和Western-blot结果显示:Rv1400c以包涵体形式表达,蛋白分子质量为39 ku;目的蛋白免疫新西兰兔后,ELISA检测血清效价达到1∶51 200。纯化的Rv1400c重组抗原蛋白能与鹿的阳性血清发生体外结合反应。