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根据测定的口蹄疫病毒(FMDV)2C基因序列,设计了一对特异性的表达引物,用于扩增2C基因5′-端174bp和3′-端279 bp连接片段,该区含有较丰富的B细胞表位编码序列。扩增片段通过NcoⅠ和SalⅠ酶切位点插入表达载体pET-30a。序列测定表明,目的基因片段连接正确,按正确的读码框插入表达载体中。重组表达质粒转化BL21(DE3)pLys,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,2C基因主要表位区成功地在大肠杆菌表达,表达产物为约23 ku的融合蛋白,能够与FMDV感染动物血清发生特异性反应,而不与健康和灭活疫苗免疫动物血清反应。该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫转印(EITB)方法提供了所需的材料。 相似文献
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大肠埃希氏菌表达FMDV3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测 总被引:7,自引:2,他引:7
采用超声波裂解细菌,高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV3AB非结构蛋白进行纯化,经SDS—PAGE分析,3AB融合蛋白纯度达90%以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性,通过Westernblotting分析,表明复性后的3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明,复性后的3AB融合蛋白有很好的抗原活性。 相似文献
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口蹄疫自然感染动物与免疫动物鉴别诊断研究进展 总被引:5,自引:0,他引:5
口蹄疫是偶蹄动物高度接触性传染病 ,能引起巨大经济损失。国际兽医局将其列为 A类动物传染病之首。除发达国家外 ,大多数发展中国家都采用注射疫苗的办法来控制该病的流行。因此如何区分感染动物和免疫动物是口蹄疫防制中迫切需要解决的问题。目前口蹄疫灭活疫苗的生产工艺可以将绝大部分的非结构蛋白除去 ,因而灭活疫苗免疫动物只能产生结构蛋白抗体 ,而感染动物能产生结构蛋白抗体 ,也能产生非结构蛋白抗体 ,因此 ,检测非结构蛋白抗体为鉴别口蹄疫感染动物与免疫动物提供了美好前景。文章从鉴别诊断的原理 ,非结构蛋白的免疫特性 ,鉴别诊断所面临的问题及解决方案 ,应用非结构蛋白作为鉴别诊断抗原的研究现状等方面进行了综述。 相似文献
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口蹄疫病毒结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测 总被引:5,自引:0,他引:5
以口蹄疫病毒OLZ02株基因组序列为材料,采用Garnier—Robson法、Chou-Fasman法和Karplus—Schulz法预测了其结构蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle法分析了各结构蛋白的亲水性,Emini法预测了各结构蛋白的表面可能性,Jameson—Wolf法预测了各蛋白的抗原指数,综合评价了口蹄疫病毒结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,VPl蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多,是研制口蹄疫基因工程疫苗的首选免疫原,但其他结构蛋白也含有少量的B细胞抗原表位,有的甚至有可能成为优势抗原表位。 相似文献
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固定细胞免疫过氧化物酶技术是近年推出的新方法,用于检测和分析病毒诱导抗原及细胞表面受体,是细胞酶联免疫吸附试验(ELISA)的发展。这种技术克服了以前许多方法的不足。现将其原理、方法及应用情况浅述如下:一、原理将病毒感染的单层细胞或靶细胞用化学试剂(多聚甲醛或丙酮)固定在微量平底96孔塑料培养板上,加适量的特异性抗体(单抗)作用后洗涤,用过氧化物酶标记的抗小鼠 FC 抗体封闭抗原抗体复合物,然后加底物 H_2O_2,终止反应后测其415nm的 OD 值。二、方法1.病毒感染细胞敏感细胞以单层培养在96孔平底塑料培养板上,待细胞生长成密集的单层, 相似文献
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Ⅲ型干扰素(IFN-λ)是一种新发现的抗病毒因子,在天然免疫和获得性免疫应答方面具有多重功能;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后造成猪的免疫抑制状态,Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的应答受到抑制,IFN-λ的应答情况还不清楚。为揭示PRRSV感染猪后IFN-λ的应答情况与调控机制,以期进一步揭示PRRSV抑制宿主抗病毒免疫应答的分子机理。利用PRRSV强毒与弱毒株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测IFN-λ在mRNA与蛋白水平的差异,并检测了不同非结构蛋白(NSP)对IFN-λ的调控作用。结果发现PRRSV感染PAM细胞后均在mRNA水平上诱导IFN-λ1和IFN-λ3表达上调,且IFN-λ3比IFN-λ1上调更明显;然而在蛋白水平上二者均为表达下调。人源IFN-λ3比IFN-λ1显示出更强的抑制PRRSV复制的作用,且对强毒株GSWW/15的抑制效果更明显。PRRSV NSP7b和NSP9转染PK-15细胞后能使IFN-λ3的mRNA上调表达,但蛋白水平无变化;而NSP7a对IFN-λ3的mRNA和蛋白水平均无影响,提示NSP7b和NSP9可能通过某种机制抑制IFN-λ3的应答。 相似文献
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口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达 总被引:4,自引:1,他引:4
将牛源O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)China/99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM-T-3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx-4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx-3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE可检测到分子量约为59.1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31.4%。Western blotting分析证明表达产物能被FMDv阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。 相似文献
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在2010年上半年,猪O型口蹄疫不断发生,作为国内几个生产厂家的猪口蹄疫现用疫苗种毒的提供者,我组进行了猪源流行毒对该种毒灭活疫苗免疫猪的攻毒保护试验及观察。结果如下:1)、猪源流行毒致猪发病速度慢。猪源流行毒接种猪后,致猪发病的时间在3~5天,而疫苗株致猪发病时间是接种后2~3天;2)、该疫苗毒株能有效抵抗猪源流行毒的攻击,PD50大于6;3)、免疫保护和ELISA抗体水平没有线性相关性;4)、免疫保护与140S抗原量有相关性。 相似文献
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为了鉴定湖北省某猪场水疱性疾病的病原,本研究采用RT-PCR、细胞分离培养、间接免疫荧光检测、电镜观察、病毒基因序列测定及分子进化分析的方法对湖北省某猪场采集的具有水疱样病变的猪水疱皮样品进行了病毒的分离和鉴定及全基因组序列的测定。结果表明:成功分离到1株A型塞内卡病毒(SVA),命名为HBWH/1/2018株。该毒株接种BHK-21细胞培养能够引起明显的致细胞病变效应;免疫荧光试验结果为阳性;病毒滴度为109.35 TCID50/0.1mL;该毒株基因组全长7281 bp(不包括Poly A),开放阅读框为6546 bp,编码2181个氨基酸;VP1核苷酸序列的遗传进化分析表明HBWH/1/2018株与HN01/2017株亲缘关系最近(相似性高达99.4%),而与SVA原型毒株SVV-001株的亲缘关系最远(相似性为91.3%)。本研究不仅丰富了SVA的分子流行病学数据,也为进一步研究SVA的致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础。 相似文献