鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)L基因和番鸭细小病毒(MDPV)Vp3基因的保守序列,采用Primer Premier 5.0软件设计并合成了2对引物。通过优化反应条件及特异性、敏感性评价,建立了能同时检测鸭源NDV和MDPV的二重PCR方法。该方法对鸭源NDV和MDPV的检测敏感性分别为30和16 fg。同时使用该方法对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌进行检测,结果显示全为阴性。本研究建立的鸭源NDV和MDPV的二重PCR检测方法,具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭源NDV和MDPV感染的快速鉴别检测。     

贝类单孢子虫半套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中单孢子虫的基因保守序列,设计了3条特异性引物,通过对半套式PCR扩增条件的优化,本研究建立了检测贝类单孢子虫的半套式PCR方法。该方法对单孢子虫模板进行扩增,得到与预期相符的333 bp特异性条带,而对折光马尔太虫、派琴虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到0.011 fg单孢子虫质粒DNA。用该半套式PCR对青岛沿海的贝类样品进行检测,结果从牡蛎和菲律宾蛤仔中分别检出单孢子虫6和8份,提示青岛沿海的养殖贝类中存在单孢子虫感染。结果表明,本研究建立的半套式PCR方法可用于贝类单孢子虫的临床快速检测。     

Ⅰ群禽腺病毒双价油乳剂灭活苗的研究

[目的]提高国内Ⅰ群禽腺病毒疫苗的防控能力,防止Ⅰ群禽腺病毒蔓延.[方法]优化Ⅰ群禽腺病毒的增殖条件,以Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAV-4)及血清8型(FAV-8)的抗原液制备油乳剂单价及双价灭活苗,比较甲醛及β-丙内酯(BPL)的灭活效果,并检验疫苗性状、监测免疫抗体水平及进行免疫攻毒试验和田间试验.[结果]疫苗灭活以1.00 mL/L终浓度的甲醛或0.500 mL/L终浓度的BPL为宜;3种疫苗均为白色状乳液,4 ℃下保存期均可达12个月,单价疫苗的最小免疫剂量为100 μL/羽,双价疫苗的最小免疫剂量为250 μL/羽;免疫抗体水平监测结果表明,免疫后第4周抗体水平达到峰值,且在免疫后第8周仍维持较高水平;免疫攻毒试验结果显示,3种疫苗的保护率均为100%,能完全抵抗病毒攻击;田间试验结果表明,在免疫初期3种疫苗抗体均达到预期免疫效果,免疫保护期在6个月以上,在生产中使用双价疫苗可以减少注射次数.[结论]FAV-4、FAV-8双价油乳剂灭活苗免疫效果好、保存期长、安全性好,为净化Ⅰ群禽腺病毒提供了技术支撑.     

鸡细小病毒半巢式PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、特异、灵敏的检测鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的方法,根据ChPV的保守基因NS1设计了3条特异性引物,建立并优化了能快速检测ChPV的半巢式PCR方法,对其进行特异性和敏感性试验,并用所建立的方法对48份临床样品进行了检测。特异性和敏感性试验结果显示,建立的半巢式PCR只对ChPV敏感,扩增产物为186 bp的特异性条带;其最低能检测到5.62 fg/μL的ChPV DNA;而对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒不敏感。临床检测结果显示,同时对48份临床样品进行检测,检出率为16.67%（8/48）,提示广西区内鸡群存在ChPV感染。本研究建立的ChPV半巢式PCR方法适用于ChPV的临床检测。     

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

[目的]建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持.[方法]根据GenBank已发表NDV的F基因序列(GenBank登录号JX840454)和APV的F基因序列(GeneBank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性.[结果]优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(LaSota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现.二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA.应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致.随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(GenBank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(GenBank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%.[结论]针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持.     

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫和折光马尔太虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别这2种原虫的二重PCR。对同一样品中的单孢子虫和折光马尔太虫模板DNA进行扩增,得到2条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)和478 bp(折光马尔太虫)的特异性扩增带,而对派琴虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果均为阴性。敏感性试验表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫和折光马尔太虫DNA。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒2型二重实时荧光定量PCR检测方法的建立

以胸膜肺炎放线杆菌(App)apx ⅣA基因和猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因为靶基因,分别设计特异性引物和探针,建立App和PCV-2的二重荧光PCR方法。App引物扩增的目的片段大小为132bp,PCV-2为169bp。建立的方法可在同一反应体系中同时对App和PCV-2进行定量检测鉴别,其敏感性分别为1×101拷贝和1×100拷贝,对其他猪病病原核酸的检测为阴性。利用该方法对10份人工感染临床样品进行检测试验,其结果符合率达100%,说明该方法可用于对临床样品中App和PCV-2的检测。     

罗非鱼荧光假单胞菌的分离鉴定

从发病罗非鱼中分离获得1株革兰氏阴性杆菌,依据细菌形态、培养、生理生化特性初步鉴定为荧光假单胞菌,结合PCR检测、克隆测序及Blast比对分析,进一步确定该分离菌株为荧光假单胞菌。致病性试验结果显示,该分离菌株具有较高的致病性,能引起罗非鱼发病、死亡,其病理变化与荧光假单胞菌引起的鱼类赤皮病完全相似。药敏试验结果显示,该分离菌株对氟哌酸、氧氟沙星、新霉素高度敏感,但对氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林等不敏感。     

禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法的建立

【目的】建立用于检测禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）且能同时区分H1和H3亚型AIV的方法,为有效防控禽流感（Avianinfluenza,AI）奠定基础。【方法】根据H1亚型、H3亚型AIV-HA基因和M基因的保守核苷酸序列,分别设计3对特异性引物,以含有H1亚型AIV和H3亚型AIV的cDNA为模板,对三重PCR扩增条件进行优化,验证其特异性和敏感性,并对临床样品进行AIV检测。【结果】H1和H3亚型AIV混合模板经三重PCR扩增可获得3条特异性条带,其中302bp为H1亚型HA基因、453bp为M基因、626bp为H3亚型HA基因;含有H1或H3亚型AIV的模板均出现两条特异性条带,大小分别为302和453bp、453和626bp;含有其他亚型AIV的模板仅出现一条特异性条带（453bp）;而其他禽呼吸道疾病病毒均未扩增出任何条带。优化后的三重PCR最低能同时检测出7.00pg的H1亚型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的H3亚型AIV;对100个临床样品进行AIV检测,AIV总阳性率为36%,其中H1亚型阳性率4%、H3亚型阳性率9%、其他亚型阳性率23%。【结论】禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等特点,适用于AIV的检测及H1和H3亚型AIV的分型检测。     

3株鸡传染性贫血病毒的全基因组序列分析

通过对3株鸡传染性贫血病毒(CIAV)的全基因组序列比较分析,部分表明广西南宁鸡群CIAV毒株的遗传变异特征。将阳性CIAV的组织样品进行DNA抽提后,运用PCR方法分段扩增CIAV的全基因组,将获得的PCR产物进行基因克隆并进行阳性克隆菌鉴定后送测序。将所获得的基因序列进行拼接成CIAV基因组全长后,应用LaserGene7.1和MEGA4.1软件对CIAV全基因、Viral protein 3(VP3)、Viral protein 1(VP1)和Viral protein 2(VP2)基因序列进行核苷酸、氨基酸同源性分析和遗传进化分析;并对VP1、VP2和VP3蛋白上与毒力、蛋白磷酸酶活性和细胞凋亡相关的氨基酸位点进行分析。结果获得3株CIAV的全基因序列,分别命名为GX1801、GX1804和GX1810;CIAV全基因遗传进化分析表明GX1801、GX1804和GX1810均同属于Group A群,与国内强毒株GD-103和GD-104毒株的亲缘关系较近;基于VP1基因构建的遗传进化树与全基因构建的进化树最相似;GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白上与毒力相关位点的第75、89、125、141、144、394位氨基酸位点与日本强毒株C368株、国内强毒株GD-103和GD-104株在同一位点保持一致;GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白上与磷酸酶活性相关的基序(I^94CNCGQFRKH^103)均未发生变异;GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白与诱导细胞凋亡相关的重要区域(VP3蛋白N端结构域的第1~69位氨基酸)均高度保守。本研究对3株CIAV全基因组进行测定并进行基因分析,获得了其基因组特征,为进一步研究广西CIAV的分子流行和致病性提供参考。