猪萨佩罗病毒3C蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪萨佩罗病毒(PSV)的血清学方法,本研究以原核表达的PSV 3C重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PSV重组3C蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该ELISA方法仅对PSV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法的批内和批间重复性变异系数均小于10%,血清稀释度可以达到1∶320;采用该ELISA方法对我国2016年间采集的江苏省6个不同地区猪场的281份临床血清样品进行了检测,阳性率高达38.43%,表明江苏地区猪群中存在PSV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PSV抗体,特异性强、敏感性高、重复性好,是PSV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。     

中国猪群存在Torque teno Virus(TTV)感染

为了探讨中国猪群TTV的感染现状以及是否存在新的基因亚型,基于TTV1和TTV2相对保守的5′非翻译区(5′UTR)设计引物,采用PCR法对2008~2009年采集于中国江苏省的138份猪血清进行了检测。结果表明,中国猪群TTV1的感染率为15.9%,TTV2的为34.8%,共感染率为5.8%。所扩增片断的核苷酸序列分析结果表明,中国TTV1和TTV2流行毒株之间的核苷酸同源性分别为87.3%~93.8%和74.8%~99.1%,与GenBank其他TTV1和TTV2毒株的同源性分别为69.6%~100.0%和74.8%~99.1%。系统进化分析结果表明,中国TTV1和TTV2流行毒株存在新的基因亚型。     

猪链球菌4型GalR蛋白的生物信息学分析及原核表达

试验旨在了解猪链球菌4型（Streptococcus suis serotype 4,SS4）转录调控因子GalR蛋白生物学信息并对其进行原核表达。使用相关生物信息学分析网站对SS4 SH1510菌株GalR蛋白进行序列同源性和功能结构域检索,并对信号肽、跨膜区和等电点进行预测;同时,对SS4 SH1510菌株GalR基因进行扩增、原核表达、纯化,并用SDS-PAGE分析重组蛋白的可溶性,用Western blotting鉴定重组蛋白的反应原性。氨基酸序列比对显示,SH1510菌株GalR蛋白与变形链球菌、无乳链球菌、绿脓杆菌、马链球菌兽疫亚种、肺炎链球菌、口腔链球菌及李斯特菌的GalR家族蛋白的氨基酸序列分别具有57%、56%、55%、55%、52%、52%和49%的同源性;结构域检索发现GalR蛋白N-末端具有螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix,HTH）基序的小DNA结合结构域,C-末端具有Ⅰ型周质结合蛋白折叠的调节配体结合域,在这两个功能结构域的中间含有一个约18-氨基酸的连接子;GalR蛋白无信号肽,无跨膜区,等电点为5.10。SDS-PAGE分析显示,GalR蛋白绝大部分表达在上清,分子质量为56 ku;Western blotting鉴定结果显示,His单克隆抗体和粗制SS4多克隆抗体兔血清能特异性识别可溶性GalR蛋白。本研究对GalR蛋白进行了生物信息学分析并成功地表达和纯化了GalR蛋白,为进一步研究GalR蛋白在SS4中的作用奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒变异株N基因的克隆及原核表达

猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea,PED)是我国猪群近两年的多发疾病。本试验于2012年在安徽分离到一株猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)AH2012。为研究该变异株N基因的特性,采用RT-PCR方法获得了其N基因片段,经测序后与其他代表性的PEDV基因序列进行同源性比较和遗传进化分析,发现该毒株与近年来在我国流行的几株PEDV变异株同源性在99.3⁹9.5%之间,进化分析显示该毒株属于目前流行的PEDV变异株。将其克隆到表达载体pET28a(+)中,构建了重组质粒pET28a-N,经测序鉴定正确后,转化至感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为65 ku的融合蛋白,蛋白表达量较高,蛋白免疫印迹结果显示,表达的N蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性的免疫反应,表明原核表达的N蛋白具有良好的反应原性。该研究可为猪流行性腹泻病的流行病学调查、诊断与防控方法的建立奠定基础。     

猪链球菌4型分离株生物学特性研究

为分析猪链球菌4型(Streptococcus suis type 4,SS4)分离株的病原生物学特性,试验对来自中国不同地区的10株猪链球菌4型进行了多位点序列分型,通过PCR方法对猪链球菌7个保守管家基因aroA、gki、dpr、mutS、recA、thrA、cpn60进行扩增,测序后将结果上传至MLST数据库查找序列型,然后制作聚类分析图来阐明菌株之间的亲缘关系;采用PCR方法对7种主要的毒力基因gdh、mrp、epf、sly、fbps、gapdh与orf2进行鉴定,通过毒力因子谱来分析猪链球菌4型毒力因子的分布;以纯化的10株细菌对BALB/c小鼠进行动物致病性试验,根据小鼠致死数量筛选出最强毒株,并进行新西兰兔致病性试验。结果显示,10株猪链球菌4型经多位点序列分型,6株为ST850型,3株为ST1006型,1株为ST94型;结合菌株分离地区分析发现,广东和江苏地区菌株有较高的同源性,江沪地区菌株出现分化现象,表现为遗传多样性;10株菌株均检测到了gdh、gapdh和orf2毒力基因,7株检测到sly基因,4株检测到fbps基因,根据毒力因子谱发现共有3个毒力基因型,gdh+sly+gapdh+orf2+型有6株,gdh+fbps+gapdh+orf2+型有3株,gdh+sly+fbps+gapdh+orf2+型仅有1株。动物致病性试验表明,10株细菌均能使BALB/c小鼠死亡,其中SH1510的半数致死量低至1×108 CFU,对小鼠的致病性最强,将纯化的SH1510菌液接种新西兰兔,可使新西兰兔出现典型的神经症状并死亡。以上结果为猪链球菌的遗传进化、毒力研究提供了新的数据,丰富了猪链球菌病的研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)江苏分离株NJGC ORF5基因的克隆及遗传变异分析

为了分析江苏省流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异特征,采用RT-PCR方法对江苏地区分离的PRRSV NJGC株的ORF5基因进行了克隆和测序,利用DNAstar软件与国内外代表性毒株进行了同源性分析与序列对比,并绘制了系统进化树.结果表明:NJGC株属于美洲型PRRSV,其ORF5基因与美洲型代表毒...     

Preparation and Identification of Specific Monoclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2

以人工合成 PCV2 Cap蛋白表位的串联多肽作为抗原免疫 BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了1株稳定分泌抗PCV2-rCap 蛋白的杂交瘤细胞株,命名为670#。该株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价为l∶100000。 Western blot结果显示,该株单抗可与表达原核 PCV2 PET32a-ORF2重组蛋白、真核表达 ORF1-ORF2串联蛋白及 PCV2全病毒细胞培养物反应;间接 ELISA证明该单核可与 ORF1-ORF2串联蛋白结合;IFA结果表明,该单抗可与天然PCV2病毒结合。该单抗的制备为 PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。     

猪链球菌2型在家兔体内的分布及致病性

用猪链球菌2型SS2-1株按109 CFU/只分别以静脉、肌肉、皮下、滴鼻、口服5种途径人工感染健康家兔,结果前4种感染途径均可引起发病并死亡,口服不发病,且以静脉感染发病最急。当分别静脉注射109,108,107,106,105 CFU/只SS2-1株,肌肉注射108,106 CFU/只SS2-1株,结果证实感染剂量与发病程度有正相关性,家兔临床症状和病理变化明显。用荧光定量PCR方法检测所有感染家兔组织的含菌量,结果提示发病程度与含菌量呈正相关,且各组织含菌量有差异。另外,人工感染家兔后在不同时间点取动物组织做菌体含量动态监测,结果提示体内含菌量随时间推移递增,发病高峰或死亡时达最高值。试验结果证明SS2-1株对家兔易感,致病性稳定,且细菌在动物体内增殖稳定并具有规律性。     

猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用

根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的核酸进行扩增,均无PCV3目的条带出现;随机抽取扩增的16份临床病猪样品目的条带进行TA克隆后测序,结果显示均为PCV3特异性目的片段,16株PCV3江苏毒株扩增序列与已报道的PCV3/US/SD2016和PCV3/CN/Hubei-618基因序列同源性分别为98.4%~99.6%、99.0%~99.8%,而16个毒株之间的同源性为98.3%~100%。利用所建立的PCR方法检测了2014~2017年间收集的江苏省临床病猪样品938份、健康猪样品500份,PCV3的阳性检出率分别为6.93%和0.6%;其中,2014年病猪样品中的阳性率为1.92%,后呈逐渐上升的趋势,2017年达到12.67%。本研究表明,建立的PCR方法特异、敏感,可以用于临床PCV3的检测;PCV3在江苏省猪群2014年已有感染,并呈逐年升高的趋势,应予以重视。     

2013～2014年猪嵴病毒分子检测和3D基因遗传变异分析

[目的]为调查猪嵴病毒（ PKV）在我国哺乳仔猪中的流行和变异情况。[方法]采集2013～2014年我国5个省份27个猪场224份哺乳仔猪腹泻粪样,采用 RT-PCR方法对 PKV的3D基因进行检测,并对其中的29个 PKV 3D基因进行序列测定和遗传变异分析。[结果]腹泻粪样中PKV总阳性率为65.18％（146/224）,猪场PKV总阳性率为85.2％（23/27);29个 PKV 3D基因与国内外6株其他 PKV株相关序列的核苷酸同源性为87.0％～100％,所推导的氨基酸序列同源性为92.7％～100％。[结论]我国哺乳仔猪中普遍存在 PKV感染,PKV 3D基因呈现多样性。