含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性传染病,为了保证其检测结果的准确性和可靠性,需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含ASFV核酸序列的病毒样颗粒,并探究其在检测方法中的应用。首先扩增p72基因的全长片段,利用昆虫杆状病毒系统,包装出含有p72基因的ASF DNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性,本研究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取,进行实时荧光定量PCR。结果表明,本研究制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品,且能对核酸提取过程进行质控,实时荧光定量PCR检测试剂盒中,病毒样粒子的最低包装浓度为10² TCID₅₀。进一步研究发现该病毒样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中,最低浓度分别为10³和10¹ TCID₅₀。本试验结果将为规范ASF检测方法,促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。     

O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法的建立

本研究建立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法,确立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法检测O型口蹄疫血清阴阳性判定标准：抗体效价大于或等于1：32时判为O型口蹄疫抗体阳性;1：16～1：32时判为O型口蹄疫抗体可疑。检测131份阴性血清、口蹄疫亚洲1型阳性血清和A型阳性血清,固相竞争ELISA方法和液相阻断ELISA方法的特异性分别是95．5％,84．7％。固相竞争ELISA方法检测口蹄疫亚洲1型、口蹄疫A型阳性血清时,无交叉反应,O型口蹄疫病毒感染牛、免疫牛和感染猪血清的阳性检出率均为100％,免疫猪检出率为86．7％。     

三种鉴别诊断PRRSV美洲型经典毒株和变异株的方法比较

我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）包括美洲型经典毒株和变异株。本研究应用RT—PCR、直接免疫荧光（ direct immunofluorescence asay, DFA ）及病毒分离3种检测方法对99份不同类型的猪繁殖与呼吸综合征临床疑似病料和人工感染病料进行检测。结果显示,RT—PCR检测试剂盒敏感性最高,DFA鉴别诊断试剂盒次之,病毒分离最差。DFA与病毒分离、RT—PCR的总符合率分别为92％和85．5％。RT—PCR灵敏性高,可作为PRRSV鉴别诊断的首选方法;DFA鉴别诊断法所需时间较短、特异性好,但需要一定的操作经验;病毒分离敏感性低、操作繁琐,阳性分离需要其它方法验证,不适合于PRRSV的鉴别诊断。     

水貂阿留申病毒的分子生物学研究进展

从水貂阿留申病毒(ADV)基因组特点出发,就阿留申病毒的分子生物学研究进展作以简单综述。     

番鸭呼肠孤病毒和H9亚型禽流感病毒共感染对番鸭法氏囊和抗体产生的影响

为探讨番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)共感染对番鸭法氏囊免疫应答能力的影响,本研究将MDRV或/和H9 AIV人工感染8日龄番鸭,观察法氏囊病理组织学变化,检测法氏囊B细胞增殖能力及RE-5 AIV疫苗免疫后抗体变化规律.结果显示:H9 AIV感染组番鸭发病率低(10％),无死亡,法氏囊无病理变化,显著抑制番鸭法氏囊细胞增殖反应;MDRV感染番鸭发病率70％,死亡率40％,生长迟缓,法氏囊病理变化为萎缩,淋巴细胞减少,局部出现范围较小的坏死灶,番鸭法氏囊细胞增殖反应下降;共感染组番鸭发病率100％,死亡率80％,番鸭生长迟缓,法氏囊萎缩和淋巴细胞增殖反应下降程度均比单一病毒感染组严重.病毒感染使番鸭对RE-5 AIV疫苗免疫应答能力明显下降,其共感染组抑制抗体应答程度最严重;共感染组的病毒检出时间早于并且检出率大于单一病毒感染组.表明MDRV与H9 AIV共感染在番鸭免疫应答抑制方面有协同作用.     

多重实时荧光定量PCR鉴别欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV检测方法的建立

根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够检测欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重实时荧光定量PCR方法。该方法的重复试验表明其批内和批间的变异系数最高值分别为1.84%和1.76%;灵敏性试验表明其检测下限为10copies/μL;特异性试验表明与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性;临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸;此外,本研究用欧洲型PRRSV质粒进一步验证了该方法可以检测出欧洲型PRRSV的目的基因。该方法的建立为不同类型的PRRSV快速检测提供了有效手段,可用于猪繁殖与呼吸综合征疫情的监测及防控。     

蛇钩口线虫长沙分离株ITS基因的克隆及序列分析

为研究蛇钩口线虫长沙分离株的核糖体DNA (rDNA)内转录间隔区(ITS)序列的遗传变异情况,并利用ITS序列构建蛇钩口线虫与其它线虫的种群遗传关系,本研究利用PCR扩增蛇钩口线虫rDNA的ITS片段,并克隆至pGEM-T载体中进行序列测定及分析.结果显示,长沙市各分离株的ITS序列长度均为734 bp,与其它线虫的同源性均低于83.9％,而与十二指肠钩口线虫的同源性较高.本研究为蛇钩口线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

小反刍兽疫实时荧光PCR检测方法的建立及应用

以小反刍兽疫病毒N基因序列为靶基因,通过设计引物及TaqMan探针建立快速检测小反刍兽疫的荧光PCR方法.在线BLAST分析结果表明:所设计的引物特异性强,可区分小反刍兽疫病毒及牛瘟病毒感染;所建立的方法检测线性范围为1～1×106拷贝质粒DNA,灵敏度可达10拷贝质粒DNA,是常规PCR法的100倍.应用所建立的方法对32份采自西藏疫区的组织样品进行检测,说明疫情在西藏没有扩散.     

福建省H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的进化分析

为进一步了解福建省H9N2亚型禽流感病毒的基因遗传进化关系,本研究将福建省2011年分离的毒株FZ-04、FZ-11与GenBank上登录的2000～2011年福建省分离的H9N2毒株及国内外典型代表株进行HA、NA基因的序列比对和遗传进化分析。结果表明,分离株FZ-04和FZ-11的HA基因与CK/FJ/G9/09株核苷酸同源性最高,属于国内常见的CK/BJ/1/94亚系。HA裂解位点处的氨基酸序列为-PSRSSR/GL-,符合低致病性禽流感病毒的分子特征。NA基因在遗传进化关系上呈现独立的分支,与CK/FJ/10954/05毒株核苷酸序列同源性最高,属于CK/HK/G9/97亚系,且NA基因推导的469个氨基酸序列中没有缺失。同时,从HA和NA基因的遗传进化树上可知,2000～2011年福建省H9N2禽流感病毒进化相对比较稳定,可能有一个共同的起源。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白在昆虫细胞中的表达与间接ELISA方法的建立

为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(iELISA),利用杆状病毒表达载体pFastBac HTA在昆虫细胞Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示重组蛋白大小约65ku,能与ASFV标准阳性血清发生特异性结合。以此重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测ASFV血清抗体的iELISA方法。表达的重组蛋白具有良好的特异性,为制备ASFV免疫血清学诊断检测试剂和疫苗提供了材料。