犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。     

基于荧光显色的环介导等温扩增技术(LAMP)检测禽呼肠孤病毒

建立了一种基于荧光显色的禽呼肠孤病毒(ARV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法.该检测方法使用针对ARV的p10基因8个区域的6条LAMP引物,能够在等温(63℃)条件下1h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低能够检出102个拷贝的病毒,敏感性比普通PCR高100倍,而对其他病毒检测结果为阴性.在荧光显色中分别应用SYBR Green Ⅰ和钙黄绿素作为显色剂,其结果与琼脂糖凝胶电泳一致.在对80份临床样本的检测中,使用LAMP和PCR检测出阳性样本的数量分别为68份和55份.因此,基于荧光显色的LAMP方法可以应用于ARV的快速检测,具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力.     

基于Meta分析的4种保护性耕作措施对东北春玉米生长季农田土壤水热环境影响

为探究东北水热资源限制下春玉米农田保护性耕作的合理推广,本研究基于44篇已发表文献中的2 705对数据,应用Meta分析方法比较4种保护性耕作(秸秆覆盖SM、免耕NT、免耕+秸秆覆盖NM和深松SN)与传统耕作CK下东北春玉米农田土壤温度和土壤含水量的差异,并探讨不同因素对其影响程度。结果表明：保护性耕作对生长季内的玉米农田有增湿降温的效应,土壤含水量提升5.93%和土壤温度降低2.93%;土壤含水量增加效应由大到小依次为SM>NM>SN>NT;土壤温度在SM、NT下显著降温,NM、SN显著增温,但NM增温幅度仅为0.006%。保护性耕作下土壤含水量和土壤温度在各亚组间均无显著性差异;部分亚组内土壤含水量有显著性差异,显著性依次为：土壤质地>土层深度>生育期>年均气温>年降雨量>秸秆覆盖量,土壤温度仅在秸秆覆盖量亚组内有显著性差异。此外,覆盖(3 000,6 000]kg/hm²秸秆时,蓄水保墒效果最佳。综上,在年均气温[0,10]℃的东北春玉米可种植区实施4种保护性耕作均有显著的增湿降温效应。     

猪星状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增ORF2基因片段,将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线特异,灵敏度可达1×101拷贝,是普通PCR检测方法的100倍,特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点,有重要的实用价值。     

A型猪塞内卡病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

本研究针对A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)基因组保守区域设计了特异性引物及探针,建立了快速检测SVA的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的Taq Man荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9974;特异性良好,与口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒不存在交叉反应;对SVA核酸最低检测下限为3.75 copies/μL,而普通PCR最低检测下限为3.75×103 copies/μL;批内和批间的变异系数为均小于5%,重复性良好。本研究建立的SVA TaqMan荧光定量PCR方法为检测猪水疱性疾病病原提供了一种快速、灵敏的检测方法,为开展SVA流行病学调查提供了技术支持。     

北京地区犬猫弓形虫病流行病学调查

为初步调查北京地区犬猫弓形虫感染的流病学特征,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测2010年5月至2011年4月采集的家养犬猫、流浪猫血清样本.其中,家养犬血清样本1876份,家养猫血清样本561份,检测发现,家养犬动物弓形虫IgG抗体阳性率24.9％;家养猫弓形虫IgG阳性率21.2％;同时检测流浪猫样本201份,阳性率30.3％.家养犬弓形虫血清抗体阳性率不同季节间差异显著(P＜0.05),夏季最高,为30.0％,家养猫弓形虫血清抗体阳性率不同季节间无显著差异(P＞0.05).不同性别犬猫弓形虫血清抗体阳性率无显著差异(P＞0.05).随着年龄增长,犬猫弓形虫抗体阳性率均有明显增长.对25例弓形虫抗体阳性家养犬病例和37例弓形虫抗体阳性家养猫病例进行了回访调查,结果发现,该62例动物主人的弓形虫检测结果均为阴性.     

多重PCR检测猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究

根据GenBank上已发表的猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）的VP2基因序列和猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）的gH基因序列，设计合成了两对特异引物，分别建立了PPV和PRV的单项PCR诊断方法，通过对扩增条件的筛选，最终成功地建立了PPV和PRV的复合PCR诊断方法，即利用一次PCR反应，可同时扩增PPV的751bp和PRV355bp的特异性片段，而扩增猪圆环病毒Ⅱ型（PCV．2）及相应的培养细胞（PK-15）核酸结果均为阴性，对PPV和PRV的最低检出量分别为100Pg和10Pg的DNA。该方法适合对PPV和PRV的联合检测和鉴别诊断。     

2006年至2010年山东省鸡传染性支气管炎病毒分子变异的研究

为研究山东省鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的遗传变异规律,本研究2006年～2010年从山东省发病的商品鸡中分离鉴定了17株IBV,并对其S1基因、N基因和M基因分别进行RT-PCR扩增、测序及遗传进化分析.序列分析结果表明:与疫苗株H120相比,17个分离株S1蛋白的变异程度较大,存在广泛的基因突变和氨基酸替代,多数病毒株还存在氨基酸的插入;N蛋白无碱基的缺失和插入,仅存在核苷酸的突变和氨基酸的替代;M蛋白除病毒株CK/CH/SD09/005插入3个碱基外,其它16个分离株仅存在少数的碱基突变和氨基酸替代.S1基因、N基因和M基因的系统进化分析结果表明多数分离株的3个基因在进化上相对平行,与国内分离株LX4同属一个进化分支,同源性较高;分离株SDYT0605的3个基因与疫苗株H120同源性较高,可能是免疫压力下变异的疫苗株;分离株SDTA06111、SDWF0608和CK/CH/SD09/005的S1基因、N基因和M基因分属于不同的进化分支,可能发生了基因重组.本研究结果显示基因突变、插入和不同基因之间的重组是免疫压力下IBV变异的主要方式.     

鸡新城疫病毒的分离与鉴定

从山东某鸡场的产蛋下降而无其他典型新城疫(Newcastle Disease)症状的高抗体蛋鸡群中分离到一株病毒。经过试验鉴定,该分离株具有血凝性,且可被ND标准阳性血清所抑制和中和,不能被AI(H5亚型与H9亚型)标准阳性血清抑制;该病毒的最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间(h)为50.4 h,1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数(ICPI)为1.85,6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.42,回归试验鸡出现了新城疫症状和病变,经外源病毒检测及回归试验该病毒株被确定为新城疫病毒,并属强毒型,命名为ShD-5-04。     

多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究--猪瘟病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒多重PCR引物设计

在GeneBank中查出CSFV、PPV、PRV的所有已知序列。对病毒各基因区进行同源性分析 ,确定CSFV的E2 基因 ,PPV的VP2 基因和PRV的 gⅡ基因为各病毒扩增的靶序列。利用DNAsis对上述保守区进行引物设计 ,对设计出来的 3种病毒引物利用DNAstar进行引物二聚体分析 ,以避免引物之间形成稳定的引物二聚体。选出扩增序列为CSFV 2 88bp、PPV575bp和PRV 70 0bp的 3对引物 ,并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析。避免它们之间有较高的同源性或互补性 ,从而确定了 3种病毒的多重PCR引物