三疣梭子蟹新品种“黄选1号”的选育

2005年收集鸭绿江口、莱州湾、海州湾、舟山4个三疣梭子蟹野生地理群体,构建核心育种群体,评估有效群体含量,制定合理保种模式;在5％留种率下,采用群体选育方法进行新品种培育.到2010年经过连续5个世代选育,形成特征明显、性状稳定的三疣梭子蟹新品种“黄选1号”.在相同养殖条件下与商品苗种进行对比测试.“黄选1号”收获时平均个体体重提高20.12％,成活率提高32.00％,全甲宽变异系数小于5％“黄选1号”新品种2010～2012年进行中试养殖200余hm2,养殖方法以“蟹、虾、贝、鱼”多品种生态养殖为主.结果显示,新品种收获时个体规格大、成活率高、整齐度好,平均单产提高30％;已推广到山东、河北及浙江等地,累计养殖面积6 000余hm2,获得较显著的经济效益和社会效益.     

盐度胁迫对三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中游离氨基酸含量的影响

为探究不同盐度环境下三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中游离氨基酸(free amino acids,FAAs)的含量及浓度的变化规律,明确FAAs的组成以及在盐度适应中发挥的作用,丰富FAAs在甲壳动物盐度适应领域的研究,为后续分子机理的研究提供依据,实验设定胁迫盐度分别为10、20、40、50,以正常海水(盐度33)为对照,用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定三疣梭子蟹血淋巴与肌肉组织中游离氨基酸的组分,分析不同盐度环境下三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中FAAs的含量及变化规律。结果显示,在正常海水中三疣梭子蟹血淋巴和肌肉中含量较高的FAAs主要为牛磺酸(Tau)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)。盐度为10~50,梭子蟹肌肉和血淋巴总游离氨基酸(total free amino acid,TOFAA)的含量随盐度的增加而显著升高,非必需氨基酸(non-essentical free amino acid,NEAA)的含量随盐度的升高而上升,而必需氨基酸(essentical free amino acid,EAA)的含量变化不显著,因此,TOFAA在渗透压调节方面的作用主要取决于NEAA。发挥主要渗透压调节作用的FAAs为脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。Ala、Gly、Asp、Glu属于鲜味氨基酸(taste amino acid,TAA),研究表明,NEAA中的TAA在渗透压调节方面作用显著,Pro含量的升高对TOFAA含量的增加作用显著,盐度为40~50尤甚,表明Pro在梭子蟹高渗调节中发挥重要作用。     

日本蟳4个地理群体遗传变异的同工酶分析

采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直电泳技术对中国沿海的大连黑石礁、山东莱州湾、江苏海州湾和浙江象山4个日本蟳地理群体的10种同工酶进行检测,并分析了群体间的生化遗传差异。实验共记录了28个座位,其中m-Mdh-1、Sod-3、Cat-3、Est-1、α-Amy-1、α-Amy-4、Ldh-2、Alp-1和Alp-3共9个座位表现为多态,4个群体的多态座位百分数（P0.99）均为32.14%,平均每个座位等位基因有效值Ae为1.283 0～1.297 9,平均预期杂合度He为0.146 2～0.155 6,平均观察杂合度Ho为0.273 8～0.278 3,遗传距离D为0.000 4～0.001 8。4个群体的聚类分析表明,莱州湾和大连群体亲缘关系最近,而象山群体与其他3个群体遗传距离较远。实验结果表明,日本蟳遗传多样性处于较高水平,种质资源维持良好,有利于其种质资源的开发及遗传改良等工作的开展。     

三疣梭子蟹型微卫星标记的发掘及多态性分析

为发掘三疣梭子蟹Ⅰ型微卫星标记,实验运用生物信息学方法,从NCBI数据库已公开的13 985条三疣梭子蟹EST序列中搜索微卫星位点.结果显示,共搜索到287个微卫星位点,其中主要为二核苷酸重复序列(173个),占总数的60.3％;其次为三核苷酸重复序列(79个),占总数的27.5％;四、五、六核苷酸重复位点较少;在二核苷酸重复位点中,AC/GT重复位点最为丰富,占二核苷酸重复位点总数的53.8％,AG/CT重复次之,占二核苷酸重复位点总数的37.0％,AT和GC重复较少.挑选14个Ⅰ型微卫星标记在野生三疣梭子蟹群体中进行多态性检测,发现8个位点呈多态性,平均多态信息含量(PIC)和平均遗传杂合度(H)分别为0.57和0.63.其中6个多态性位点的PIC值大于0.5,呈现较高多态性特征.研究表明,基于三疣梭子蟹EST数据发掘Ⅰ型微卫星标记的方法切实可行.本研究发掘的Ⅰ型微卫星标记将为三疣梭子蟹遗传多样性评估、遗传连锁图谱构建和QTL分析提供有效的分子标记.     

三疣梭子蟹氧化磷酸化代谢在家系近交中的变化

为探究近交对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)氧化磷酸化代谢的影响,首先克隆了三疣梭子蟹线粒体呼吸链4个复合体关键亚基基因的c DNA全长,分别命名为pt Ndufv2、pt SDHC、pt Cytochrome c1与pt COX6B。pt Ndufv2基因c DNA全长1005 bp,编码234个氨基酸,该蛋白是复合体Ⅰ的核心亚基Ndufv2;pt SDHC基因全长915 bp,编码由179个氨基酸组成的复合体Ⅱ关键亚基SDHC;pt Cytochrome c1基因全长2371 bp,编码由313个氨基酸组成的亚基Cyt c1;pt COX6B基因全长1171 bp,编码由105个氨基酸组成的COX6B亚基。生物信息学分析显示,这些复合体亚基基因进化上比较保守。酶活检测及RT-PCR结果表明,随着近交系数的增加,三疣梭子蟹肝胰腺中复合体Ⅰ、复合体Ⅲ活力分别从F4、F2开始呈现显著下降趋势(P0.05);F10复合体Ⅳ酶活力显著低于其余各代(P0.05);4个复合体基因表达量均显著下降,且各代表达量显著低于F0(P0.05)。在心脏中,复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活力分别从F2、F2、F6开始显著下降(P0.05);pt Ndufv2与pt Cytochrome c1基因表达量分别从F2、F4开始显著下降(P0.05),这一结果证实近交衰退已出现在三疣梭子蟹氧化磷酸化代谢通路。     

三疣梭子蟹核受体基因HR38的克隆及其在蜕皮中的表达分析

采用RACE技术,克隆出三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)核受体基因HR38的c DNA全长,命名为PTHR38。该基因c DNA序列全长为2950 bp,5′和3′非编码区(UTR)长分别为101 bp和551 bp,开放阅读框(ORF)长2298 bp。推测编码765个氨基酸,预测分子量为84.2 k D,理论等电点为6.3。生物学分析预测,PTHR38基因编码的蛋白属于不稳定蛋白,不具有跨膜结构域。同源性分析表明,PTHR38基因编码的氨基酸序列与大型溞(Daphnia magna)的同源性最高。实时荧光定量分析表明,PTHR38基因在蜕皮周期的各个组织中均有差异表达,在眼柄中表达差异最大。去除单侧眼柄后,PTHR38的表达量在整体上呈现不同程度的上升趋势。     

三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。     

利用16S rRNA和COI基因序列对三疣梭子蟹不同群体遗传特征的比较分析

采用PCR扩增技术对三疣梭子蟹日本北海道群体、韩国东海岸群体和我国山东即墨市会场村群体3个野生群体的16S rRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度为523和658bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了不同群体间的序列差异和遗传多样性水平。结果显示,我国会场三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性水平较低。用MEGA4.0软件中的NJ法构建的分子进化树,基于16S rRNA片段构建的NJ系统树所反映的分类关系与基于COI基因片段构建的系统树并不一致,主要不同在于与日本蟳的分类关系上,基于16S rRNA基因片段构建的NJ系统树显示梭子蟹科的3个属聚为两大支:三疣梭子蟹不同的单倍型先聚在一起,再和梭子蟹属的远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚为一支;而青蟹属的3种蟹先聚在一起,再和日本蟳聚为一支。而基于COI基因片段构建的系统树显示,梭子蟹属先与青蟹属的两种蟹聚为一支,然后再与日本蟳聚在一起。本研究共发现19种单倍型,我国会场群体与日本北海道群体、韩国东海岸群体均有共享单倍型,表明我国会场群体与国外两个野生群体的遗传背景相似。这些资料为我国三疣梭子蟹的种质资源保护和利用提供了基础的分子生物学依据。     

三疣梭子蟹3个地理种群杂交子一代生长和存活率的比较

为了培育三疣梭子蟹Portunus trituberculatus新品系,开展了不同地理种群内自繁和种群间杂交的工作,获得了3个自繁群体和4个杂交群体,ZZ1、LL1和HH1分别来自舟山野生种群（ZS）、莱州湾野生种群（LZ）和海州湾野生种群（HZ）自繁一代;ZL1和LS1是ZS与LZ杂交一代,HL1和LH1是LZ与HZ杂交一代。运用方差分析对7个子一代群体的5个主要生长性状（全甲宽、甲宽、甲长、体高、体重）进行了比较,发现一些性状在7个子一代群体之间表现出显著差异,计算各项生长性状及存活率的杂种优势,4个杂交子一代群体在一些性状方面表现出杂种优势（0．33％～46．12％）,但不同杂交组合间和不同性状间的杂种优势存在差异,有的性状甚至表现出杂交劣势。获得的7个群体将成为进一步选育的基础群体,子一代变异性的增加为进一步选育奠定了基础。     

三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其 在低盐适应中的表达分析

甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919 bp,包括4832 bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15 kDa,理论等电点为4.68。结构预测发现,Pt DNMT1有2个特殊的结构域,分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示,PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现,PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6 h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12 h (4倍),随后逐步下降,在72 h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24 h),且上调倍数高于鳃(8倍);低盐胁迫后Pt DNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72 h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因,根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况,推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。