CRISPR/Cas9介导的绵羊示踪脐带间充质干细胞系的建立

【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞的临床治疗与分化机制研究奠定基础。【方法】根据绵羊ROSA26的基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2设计合成3对引物,利用点突变法,以px330质粒为模板分别进行PCR,DpnⅠ去除质粒DNA后,PCR产物自身环化,酶切测序鉴定,构建以绵羊Rosa26为靶标基因的sgRNA/Cas9载体,构建的质粒含Cas9和向导RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表达盒,由U6启动子驱动表达。将上述载体分别利用脂质体转染绵羊脐带间充质干细胞(sUMSCs),提取其基因组PCR后进行T7E1酶切,琼脂糖电泳分析条带灰度以检测载体编辑活性。根据sgRNA序列在绵羊ROSA26靶位点的上下游设计并合成左、右同源臂扩增引物,提取绵羊全基因组为模板分别进行PCR扩增得到左右同源臂,回收纯化后分别与pMD19-Simple连接,酶切测序鉴定获得左、右同源臂重组质粒。根据PCR引入的酶切位点,将左同源臂质粒和Donor表达载体DC-DON-SH02 ROSA26进行酶切连接,鉴定获得左臂重组打靶载体,使用相同方法将右同源臂质粒连接到左臂打靶载体上,鉴定获得Donor打靶载体,载体携带嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。在生长良好的sUMSCs中加入不同浓度的嘌呤霉素,观察细胞存活时间,确定最佳抗性筛选浓度和时间。利用脂质体共转sgRNA/Cas9载体和Donor载体到绵羊间充质干细胞,在其ROSA26位点切割DNA双链,在DNA断裂处通过同源重组方式引入报告基因,转染48 h后进行嘌呤霉素抗性筛选,筛选结束后更换正常培养基继续培养,观察绿色荧光的表达并提取阳性细胞基因组,针对ROSA26位点设计上下游两对引物对其进行PCR检测其整合情况。【结果】（1）针对绵羊Rosa26位点设计3对PCR引物,利用点突变法将sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位点上,成功构建sgRNA/Cas9载体px330-sgRNA1/2/3,将其分别转染sUMSCs,T7E1酶切结果表明px330-sgRNA2/3出现脱靶现象,未在靶位点发生编辑,px330-sgRNA1的编辑效率最高,约为20%;（2）基于sgRNA1,PCR法获得打靶载体的左、右同源臂,经一系列分子生物学方法先后连接到载体DC-DON-SH02 ROSA26上,经酶切和PCR鉴定,成功获得绵羊ROSA26位点的重组载体sROSA26-HA;（3）筛选得到sUMSCs最佳抗性浓度时间,利用Lipofectamine2000共转染sgRNA/Cas9载体和Donor重组载体到sUMSCs,1.5 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选15d至对照组细胞全部死亡,获得的阳性克隆并扩大培养。显微镜下可观察到明显的绿色荧光,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明sUMSCs的ROSA26位点发生同源重组,GFP基因被成功敲入到基因组中并能正常表达,该细胞可以用于动物疾病模型中追踪sUMSCs的去向和分化方向的研究。【结论】成功利用CRISPR/Cas9系统在sUMSCs内实现外源GFP基因的定点敲入,获得绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞进一步的临床转化奠定了基础。     

茶园花蓟马种群数量与茶叶中生化物质关系的数学分析

为明确茶园花蓟马种群数量与茶叶中生化物质的相关性,利用HPLC-ELSD法测定茶叶中生化物质的含量,再通过对茶园9种茶叶上花蓟马的数量进行Pearson相关性分析、通径分析和回归分析得出不同生化物质含量与花蓟马数量关系的密切程度,并进行综合比较与分析。通过Pearson相关性分析得出,花蓟马种群数量与茶叶中糖类含量呈显著正相关,与儿茶素类呈显著负相关;通过通径分析得出,低聚原花青素类与花蓟马的通径系数绝对值最大,其次为糖类和儿茶素类,其中低聚原花青素和糖类的通径系数为正数,儿茶素类为负数;通过回归分析得出,糖类与儿茶素类仍然是与花蓟马数量相关性最显著的2类生化物质。因此,栽植时为了避免花蓟马危害,可以选择糖类含量低或者儿茶素类含量高的茶树种类。研究结果为花蓟马抗虫育种提供了科学依据。     

农村劳动力转移对城乡收入的影响——以湖北省为例

运用DIF-GMM模型对2010—2019年湖北省农村劳动力转移对城乡收入的影响进行实证分析。结果表明：劳动力转移规模对城乡收入差距、农村居民收入和城镇居民收入有显著的正向影响,非农产业发展对城镇居民收入、农村居民收入和城乡收入差距的影响系数为正,基础设施发展对农村居民收入和城镇居民收入有显著的正向影响,对城乡收入差距有显著的负向影响。因此,为缩小城乡收入差距,促进城乡融合发展,应当着力实施加大农民教育培训投入、优化产业结构,加强交通基础设施建设等措施来促进城乡融合发展。     

奇台无芒雀麦地方品种的特征特性

本文报导了国家注册的奇台无芒雀麦地方品种(Bromus inermis L(?)yss.CV.Qitai)的品种来源及分布,品种特征特性以及主要栽培技术和利用方法,为该品种的进一步推广提供了科学依据。     

秋茬塑料大棚番茄品种比较试验

在塑料大棚秋茬栽培条件下,对7个番茄品种的植物学性状、果实性状、抗病性和产量等进行比较试验。结果表明:参试的7个番茄品种中,美娅和慧满收综合表现较好,667 m2产量分别为5 221.85 kg和5 115.97 kg,畸形果率分别为0.18%和0.11%,均无灰霉病、叶霉病和番茄黄化曲叶病毒病发生,果实均为硬果,具有产量高、商品性好、抗病性强和耐贮运等特点,具有良好的推广价值。     

基于产业结构、家庭规模视角下的广西农民收入差距实证研究

从产业结构与家庭规模视角分析广西农村居民收入差距的原因,从其发展规律中找出整体提高农村居民收入的途径。分别利用基尼系数、区位商、固定效应模型对其农村居民收入差距、产业结构、形成机制进行研究。结果表明:广西农民收入差距持续扩大,但收入分布向正态分布靠拢;家庭人口规模缩小成为农民收入提高与结构调整的催化剂;产业结构有待进一步优化,现代农业有待进一步发展;在第一产业成为专业化产业地区基础设施落后成为产业发展农民收入无法提高的致命点。建议针对不同的地区从政策转向、劳动者素质、优化产业结构和完善基础设施4个方面提高农民收入。     

日光温室基质袋培番茄灌溉监控系统设计

为了解决日光温室基质袋培番茄精准灌溉的问题,设计了日光温室基质袋培番茄灌溉监控系统。系统利用数据采集器获取日光温室相关的环境因子,结合番茄生长和水分吸收模型计算灌溉量,并通过灌溉控制器控制电磁阀开闭时间的长短进行灌溉。实验结果表明系统稳定可靠,与传统的人工灌溉模式相比,使番茄增产17.9%,节水35.4%,因此适合用于日光温室基质袋培番茄的精准灌溉。     

夜间补光对小麦叶片激素含量及光合特性的影响

为探究夜间补光对小麦生育后期的调控作用,以冬小麦品种豫农186为材料,以自然光照时间为对照,在小麦抽穗后设置夜间人工补光2h、4h和6h三个处理,研究补光时间对小麦叶片内源激素含量、光合特性及产量的影响。结果表明,夜间补光可增加小麦叶面积及旗叶叶绿素含量和光合速率,以补光6h的效果最显著。与自然对照相比,夜间补光显著增加旗叶GA3、IAA、ZR含量,且激素含量的升高幅度随补光时间的延长而增加,但ABA含量受影响较小。夜间补光能显著提高灌浆前期和中期籽粒灌浆速率及千粒重和产量,其中补光6h处理的最大灌浆速率比自然对照增大16.21%,产量提高14.07%。说明小麦抽穗后适当延长光照时间有利于叶片的生长发育,可提高激素含量和光合效率,促进籽粒灌浆,增加产量。     

微咸水微润灌溉下土壤水盐运移特性研究

为探明土壤水分和盐分在利用微咸水进行微润灌溉条件下的运移情况,采用室内土箱模拟试验方式,设置2.0、2.5、3.0、3.5、5.0 g/L 5种不同矿化度处理,以蒸馏水处理作对照,共入渗72 h。结果表明:入渗结束时在不同方向上的最大运移距离随矿化度增大呈先增大后减小趋势,在3.0 g/L处理下达到最大值,且微咸水处理的湿润锋运移距离均大于蒸馏水处理;将累积入渗量代入Kostiakov入渗公式,入渗系数随矿化度的增大呈先增大后减小趋势,入渗指数不断减小;土壤电导率以微润带为轴心向四周不断增大,在湿润锋处达到最大值,脱盐区与湿润体形状相关,呈圆环状分布;入渗结束后土壤剖面平均含盐量与蒸馏水处理之间无显著性差异,脱盐半径随矿化度的增大呈线性递减趋势;利用微润灌进行灌溉,土壤盐分存在表聚和底聚现象,且表层积盐更为严重。     

小麦钾离子通道蛋白基因TaPC1介导植株抵御低钾逆境功能研究

  【目的】  钾离子通道 (potassium channel, PC) 蛋白通过介导离子跨膜转运,增强低钾胁迫下植株对钾素的吸收和利用能力。本研究以采用RNAseq鉴定小麦应答低钾基因获得的PC家族基因TaPC1为对象,对该基因分子特征、应答低钾表达模式及其介导植株抵御低钾逆境的能力进行研究。  【方法】  采用生物信息学工具分析TaPC1分子特征,采用溶液培养法培养丰钾 (K₂O 6 mmol/L )、低钾 (K₂O 0.06 mmol/L) 处理小麦和转化株系幼苗,采用 DNA 重组技术构建TaPC1亚细胞定位和表达质粒,利用农杆菌介导法遗传转化烟草。采用常规植株形态、生理和qPCR方法测定植株生长、生理指标和基因表达。  【结果】  TaPC1与植物种属PC家族基因具有较高的同源性,该基因编码蛋白具有植物种属PC蛋白跨膜域保守特征,翻译蛋白经内质网分选后定位于细胞质膜。低钾 (0.06 mmol/L) 处理下,根、叶中TaPC1表达增强;将低钾处理植株转入丰钾 (6 mmol/L) 营养液进行恢复处理后,根、叶中该基因表达下调,表明TaPC1呈低钾应答表达模式。基因遗传转化结果表明,与野生型 (WT) 对照相比,低钾处理下,超表达TaPC1烟草株系植株干物质积累量增多,细胞活性氧累积量减少,细胞保护酶 (SOD、CAT和POD) 活性提高,丙二醛含量降低。基因表达分析表明,低钾处理下,转化株系内细胞保护酶编码基因NtSOD1、NtCAT1;1、NtPOD1;2及NtPOD1;6的转录本丰度较野生型 (WT) 显著增多,表明上述基因通过增强表达,在改善转化株系低钾处理下细胞活性氧稳态中发挥重要作用。此外,与WT相比,低钾处理下转化株系的钾累积量显著增多,光合碳同化能力增强。  【结论】  TaPC1呈低钾胁迫增强表达模式,上调表达该基因能显著增强植株钾素吸收,有效维持低钾逆境下的细胞活性氧稳态特征,在改善植株光合物质生产和抵御低钾逆境能力中发挥重要作用。