转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

甘蔗单糖转运蛋白基因ShPST2a克隆及亚细胞定位

参照GenBank中公布的甘蔗品种Q117ShPST2a基因序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法从甘蔗成熟茎秆中扩增出甘蔗单糖转运蛋白的基因序列,命名为ShPST2a,该序列长2 455 bp,包含1个2238 bp阅读框,编码745个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对ShPST2a编码蛋白进行亚细胞定位研究.结果表明,该基因编码蛋白定位于细胞膜,符合细胞膜转运蛋白的特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础.     

甲酯化油助剂对氯虫苯甲酰胺在甘蓝叶片上沉积的影响

室内模拟研究了5种自制甲酯化油类助剂与氯虫苯甲酰胺喷雾液桶混对其物理性状及在甘蓝叶片上沉积的影响。结果表明,供试5种助剂均可不同程度降低药液的表面张力及缩短药液干燥时间,并增加氯虫苯甲酰胺在甘蓝叶片上的最大持留量及抗雨水冲刷力,增强农药的渗透性。花生油酸甲酯助剂(MPOA)对药液喷雾性能改良作用最为明显。添加0.02%的MPOA可降低药液表面张力28%左右,甘蓝叶片最大持留量增加约4倍,而且可大大增强药剂的渗透性。     

不同浓度施田补对打瓜苗生长发育的影响

本文主要研究了喷施施田补后打瓜苗的生物学性状的变化。结果表明:浓度为200 mL/L、220 mL/L的施田补在不同施药深度均对打瓜的根长有显著影响;施药浓度为160mL/L,深度1 cm对打瓜的根长有显著影响;浓度为200 mL/L,施药深度为1 cm时,对打瓜的株重有显著影响。因此,在生产中需要在已施过施田补的土地上改种打瓜,可尝试进行灌水处理,降低施田补浓度,增加药层深度,以减少对打瓜生长的影响。     

棉蚜取食被棉长管蚜危害棉花后其相关酶的活性

【目的】 研究棉蚜取食受蚜害胁迫棉花后,其体内酶活性的变化。【方法】 测定棉蚜取食受棉长管蚜危害24、48、72 h,及棉长管蚜、棉蚜交互危害的棉花后,其体内过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性。【结果】 棉蚜取食经棉长管蚜危害的棉花后,体内过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性均呈上升趋势。除SOD在棉长管蚜危害48 h后达到最大值86.03 U/mg,CAT、POD、AChE、GST均在棉长管蚜危害72 h后达到最大值,分别为452.82、8.12、0.080 9和52.24 U/mg。棉长管蚜和棉蚜交互危害中,2种蚜虫取食次序和取食时间对后取食棉蚜体内酶活性变化影响较大。第1次棉长管蚜危害对后取食棉蚜CAT、SOD、AChE、GST活性变化产生显著影响,第2次棉蚜危害对后取食棉蚜CAT、POD活性产生显著影响,第3次棉长管蚜危害对后取食棉蚜POD、AChE活性产生显著影响。对CAT活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害72 h-72 h-24 h;对POD活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害72 h-72 h-48 h;对SOD活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害48 h-24 h-72 h;对AChE活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害24 h-72 h-48 h;对GST活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害72 h-48 h-48 h。【结论】 棉长管蚜危害棉花 72 h,对其后取食棉蚜体内酶活性影响最大;棉长管蚜和棉蚜交互危害中,第1次棉长管蚜危害对后取食棉蚜酶活性影响最大,第2次棉蚜危害和第3次棉长管蚜危害对后取食棉蚜酶活性影响均较小。     

高效快速甘蔗转基因方法探索

甘蔗遗传背景复杂,转基因技术是甘蔗品种遗传改良的重要途径。甘蔗转基因遗传改良主要是通过基因枪法和农杆菌介导法来实现,但目前我国的甘蔗转基因技术,普遍存在转基因效率偏低,获得的转基因株系偏少,难以筛选到目的基因稳定表达、有利用价值的转基因株系等问题。本实验室通过多年的经验积累,建立了一种高效快速的农杆菌介导法的甘蔗转基因方法。转化效率为20%,筛选效率达到90%,转化时间为4个月,操作简单,成本较低。     

液泡膜苹果酸转运蛋白研究进展

液泡是植物细胞贮藏苹果酸重要的细胞器。苹果酸是三羧酸酸循环和乙醛酸循环的中介,是维持细胞渗透压与电荷平衡的关键代谢物,还参与调节植物气孔大小,故苹果酸在植物的生命活动中起着重要作用。液泡膜苹果酸转运蛋白直接或间接控制苹果酸进出液泡,介导液泡与细胞质间苹果酸的运输。液泡膜苹果酸转运蛋白属于钠连接的羧酸盐载体家族,本文重点介绍植物液泡膜苹果酸转运蛋白的性质和功能及其与植物细胞pH值动态平衡之间关系的研究进展。     

甘蔗液泡膜二羧酸转运蛋白基因ScTDT克隆与表达分析

【目的】克隆甘蔗液泡膜二羧酸转运蛋白基因（ScTDT）,并分析其在甘蔗不同组织及在铝胁迫下的表达模式,为深入研究该基因功能及抵抗铝胁迫的分子机制提供理论依据。【方法】利用同源克隆技术从甘蔗品种ROC22中克隆ScTDT基因,利用生物信息学软件进行序列分析,采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在甘蔗不同组织（根、茎和叶）及在铝胁迫（0、10和20μmol/L Al3+）下的表达水平。【结果】克隆获得的ScTDT基因,开放阅读框（ORF）全长1623 bp,编码540个氨基酸残基,蛋白相对分子量57.34 kD,理论等电点（pI）5.77,为不稳定的疏水蛋白,可能定位于质膜、液泡和/或高尔基体,其氨基酸序列与高粱（XP_002460443.1）、水稻（XP_015612609.1）和玉米（PWZ04635.1）的TDT氨基酸序列具有高度相似性,其中与高粱的TDT氨基酸序列相似性最高,达96.30%,说明ScTDT与高粱TDT的亲缘关系最近。ScTDT基因在甘蔗根、茎和叶中均有表达,但根中表达量显著高于茎和叶（P< 0.05,下同）。在铝胁迫处理下,3个甘蔗品种（ROC22、柳城05-136和中糖1202）的根中ScTDT基因表达量较对照组（0μmol/L Al3+）均显著升高,尤其是柳城05-136和中糖1202随着营养液中Al3+浓度增加,ScTDT基因的表达量呈显著升高趋势,说明高浓度Al3+胁迫更能诱导ScTDT基因高效表达。3个甘蔗品种中,以中糖1202的ScTDT基因表达量变化最大,柳城05-136次之,以ROC22的变化最小。【结论】克隆获得的ScTDT基因表达具有组织特异性,在根中高效表达可能与甘蔗抵抗铝胁迫相关,即植株通过上调根中ScTDT基因表达,从而加快液泡中苹果酸的释放,促使苹果酸从根中分泌到土壤与Al3+反应,从而减少铝毒害,表明ScTDT基因可能参与甘蔗抵抗铝胁迫,且不同甘蔗品种的抗铝胁迫能力有所不同。     

除草剂对藨草生理生化指标的影响

采用大田小区试验方法,研究10%草甘膦水剂、48%灭草松水剂、30%苄嘧磺隆可湿性粉剂和38%欧特可湿性粉剂4种茎叶除草剂对藨草生理生化指标的影响。结果表明：用药后9 d,48%灭草松水剂1倍推荐量及10%草甘膦水剂1倍推荐量处理与对照相比,叶绿素含量显著降低;30%苄嘧磺隆可湿性粉剂和38%欧特可湿性粉剂对可溶性蛋白质、MDA 含量药后1 d影响较大,药后9 d与对照无差异或显著低于对照,而10%草甘膦水剂和48%灭草松水剂随处理后时间增加呈增加趋势。藨草体内活性氧系统POD、CAT及SOD活性明显受到除草剂影响,10%草甘膦水剂和48%灭草松水剂常量及倍量与对照相比逐渐升高,显著高于对照,而其他处理表现为先升高、后逐渐恢复至对照水平。     

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的转化

植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白参与了逆境应答,为研究甘蔗A20/AN1型锌指蛋白基因ShSAP1的功能及在甘蔗抗逆育种方面的价值,本研究通过构建ShSAP1基因的RNAi载体并进行甘蔗的遗传转化,以期通过反向遗传学进行ShSAP1的功能分析。将ShSAP1锌指编码区片段分别以正向和反向插入到中间载体pTCK303内含子的两侧,构建中间载体pTCK-iShSAP1,而后把干扰片段连入pCAMBIA-GUS中,获得RNAi表达载体pCAMBIA-iShSAP1,将该载体转导根癌农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织,并对部分转化幼苗进行了初步的PCR鉴定。经过限制性内切酶分析和测序验证,RNAi载体pCAMBIA-iShSAP1构建成功;转化幼苗经PPT抗性筛选后,获得了58株抗性植株,对抗性幼苗进行了Bar基因的PCR检测,得到6株PCR阳性植株。本研究完成了ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的遗传转化,为ShSAP1的功能研究打下了一定的基础。