池塘养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物、附着基和底泥中的菌群结构及其相关性

2014年10月,利用 PCR-DGGE 技术分析了标准化养殖池塘中仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物及附着基和底泥中细菌的菌群结构及其相关性。结果显示,仿刺参肠含物、附着基、底泥中细菌多样性较高,分别平均获得30.00±1.00、15.33±1.70、21.67±2.62条带,肠含物中细菌种类数显著高于附着基和底泥。聚类分析和戴斯系数表明,不同池塘的仿刺参肠含物样本单独聚为一支,相似性达到0.785,附着基和底泥样品聚为一支,平均相似性达到0.532。不同样品 DGGE 图谱中20条优势条带的切割、克隆、测序,共获得了20条细菌序列,表明肠含物细菌种类以聚球藻属(Synechococcus sp.)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、脱硫叠球菌属(Desulfosarcina sp.)、极地杆菌属(Polaribacter)、Algibacter sp.为主,附着基中主要以 Robiginitalea sp.和 Silicibacter sp.为主,底泥样品中主要以假单胞菌属(Proteobacterium）、噬胞菌属(Cytophaga）、Desulfosarcina sp.为主,肠含物中细菌特有种类的分离与鉴定为仿刺参养殖潜在益生菌的开发提供基础数据。     

漠斑牙鲆微卫星标记筛选及美国群体遗传结构分析

采用磁珠富集法筛选适合漠斑牙鲆遗传多样性分析的微卫星分子标记。筛选共获得43条序列,其中完美型26个,占60.5%;非完美型14个,占32.6%;复合型3个,占6.9%。选取其中14对特异性好且扩增效率高的微卫星引物,对采自美国北卡罗来纳州沿海的漠斑牙鲆野生群体和养殖群体进行遗传多样性及遗传结构比较分析。研究结果表明,12对引物的扩增产物具有多态性,其中7个位点为高度多态(PIC>0.5)。两个群体中共检测到90个等位基因。12个多态性微卫星位点在两个群体中的平均观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.36和0.57。9个位点在整个群体中呈现出不同程度的偏离遗传平衡(P<0.05),且偏离平衡的位点均表现为杂合子缺失(Fis>0)。野生群体和养殖群体间的遗传距离为0.1115,群体间的遗传分化微弱(Fst=0.0438)。     

鲢微卫星标记研制及其在鲢和鳙遗传多样性研究中的应用

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichys nobilis)是中国特有的四大家鱼中2个重要成员,主要分布于黑龙江、长江和珠江水系.传统人工养殖依靠天然鱼苗.但是,人口增长和人类经济活动加剧使其天然产卵和孵化场消失或遭到破坏.人工育苗技术虽然解决了鱼苗供应问题,但由于遗传资源管理和使用方法的不完善,使两种鱼的生长表现、抗病抗逆性和遗传多样性等都有明显的降低.另外,因洪水导致的养殖个体逃逸也使天然群体的遗传多样性受到干扰.近年来,比较大规模的人工鱼苗放流实践也加剧了对天然群体遗传多样性的扰动.对这些问题的深入研究迫切需要一套适用的分子标记.为评价鲢和鳙的遗传多样性、确定它们的遗传分化和地理分化、科学合理地管理和开发利用遗传资源,本研究构建了富集GT微卫星序列的基因组短片段文库.随机选择并测序的97个克隆中有87个含有微卫星序列.根据其中的21条序列,设计了22对微卫星标记引物并用来分析了在长江荆州段捕获的32尾野生鲢和7尾野生鳙的遗传多样性.所有标记引物在两种鱼中通用.在全部样品中共发现129个等位基因.每位点等位基因数在3～10个,平均5.9个.不同标记揭示的遗传多样性指数在0.33～2.00,平均1.22.由于使用的鱼个体数少,如鳙,只有7个个体,样品也只来源于长江荆州江段.本研究无法基于两种鱼的天然分布,对两种鱼的遗传分化、地理种群多样性比较、养殖群体和天然群体差异等问题进行深入分析.但是,这组标记的研制将有助于这2个中国特有经济鱼种的遗传多样性分析、遗传资源的管理及开发利用等相关研究.本研究中,微卫星DNA标记的研制使用了固定有微卫星核心序列的磁珠.这样的磁珠与两端接有已知序列的DNA片段杂交能富集出含有微卫星核心序列的片段.通过扩增和连接转化,可方便地获得大量含微卫星核心序列的片段.与已有的方法不同的是,本研究用AFLP方法的某些步骤使片段两端加上已知引物序列,方便易行.迄今,这两种鱼还没有微卫星标记连锁图谱.构建这样的图谱是本项目研究的长远目标.     

刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘环境中优势益生菌筛选及其特性分析

2014年12月-2015年12月,在大连地区刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘进行了春、夏、秋、冬四季有益菌分离筛选,从其水体和底泥中共分离得到66株细菌.以刺参“腐皮综合征”主要病原菌——灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌进行拮抗作用实验,利用选择培养基对菌株产淀粉酶和蛋白酶的能力进行测定,最后通过安全性实验得到潜在益生菌株YQ-2.结果显示,该菌株对灿烂弧菌和假交替单胞菌有较强的抑制作用,抑菌圈分别达到22 mm和24 mm;对淀粉和蛋白选择培养基水解圈的直径达到22 mm和36mm.安全性实验显示,该菌株无论是在108 CFU/ml浸浴还是投喂108 CFU/g的粉末饲料感染,30 d内供试刺参没有发病和死亡现象,健康程度好,且相对于对照组的体重明显增长,108 CFU/g粉末饲料投喂组的相对增长率达到39.31％.此外,本研究对YQ-2菌株的生理生化指标、16S rDNA序列进行了分析,其同源性与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain KLP2015相似度达99％,故将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌.该株枯草芽孢杆菌在大水面刺参池塘四季水体中数量为140-280 CFU/ml,高于其他菌株;同时,该菌株在水体中还具有较高的优势度,优势度分别为4.2％、3.5％、2.6％、4.6％,冬、春季节的优势度明显高于夏、秋季节;它属于土著分离菌株,对引起刺参腐皮综合征的2株病原菌具有较强的抑制作用,这对刺参大水面生态养殖具有较大的应用潜力.     

养殖长茎葡萄蕨藻黑褐病的病原学研究

本研究从大连某养殖场发生黑褐病的长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)分离得到1株优势菌株CL2017070801002。采用该菌株浓度为103~108 CFU/ml的菌液浸泡感染长茎葡萄蕨藻,在7 d内,每个感染实验组的藻体都出现了不同程度的黑褐色典型发病症状,人工感染实验结果表明,CL2017070801002对长茎葡萄蕨藻有致病性。扫描电镜观察发现,藻体细胞壁表面聚集大量细菌,随着侵染时间加长,细胞组织破裂死亡。研究表明,CL2017070801002为本次发现的长茎葡萄蕨藻黑褐病的病原。结合革兰氏染色、生理生化特征和16S rDNA序列进化树分析结果,将该菌株鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。药敏实验结果显示,该菌株对氯霉素、四环素、氟罗沙星、强力霉素和氟苯尼考等药物高度敏感,对庆大霉素、克拉霉素等药物中度敏感,对青霉素、头孢氨苄、头孢拉定等药物不敏感。本研究为长茎葡萄蕨藻的细菌性病害防治提供了有益参考。     

地榆醇提物对对虾致病菌VPAHPND生长影响及最适内参基因的筛选

为筛选适用于研究地榆(Sanguisorba officinalis L.)对对虾急性肝胰腺坏死病致病株副溶血弧菌(Acute hepatopancreatic necrosis disease caused by Vibrio parahaemolyticus, VPAHPND)抑制机理的内参基因,本文探究了地榆醇提物胁迫下VPAHPND生长的变化,并利用qRT-PCR技术探究了该条件下VPAHPND中 6种常见内参基因(rec A、pvs A、pvu A、gapdh、16S rRNA和rpo S)的表达情况,利用GeNorm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT以及Ref Finder这5种方法对其表达稳定性进行了评估和筛选。结果显示,地榆醇提物能抑制VPAHPND的生长,且抑制效果与浓度呈正相关。在不同浓度地榆醇提物处理条件下,这 6种内参基因扩增产物特异性良好,其中,Ct值变化差异最小的为16S rRNA (CV=3.88),变化差异最显著的为pvs A (CV=12.53)。5种方法对6种内参基因稳定性排序略有差异,其中,GeNorm给出的稳定性排序为rpo S = 16S rRNA > gapdh > rec A> pvu A > pvs A;Norm Finder结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Best Keeper结果为16S rRNA > rpo S > gapdh > rec A > pvu A > pvs A;Delta Ct结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Ref Finder综合排名结果为rpo S > gapdh > 16S rRNA > pvu A > pvs A > rec A。本研究根据配对变异系数结果,最终推荐同时使用rpo S和gapdh作为该条件下内参基因。本研究为以地榆为核心药物的AHPND防控技术的建立和从基因表达角度研究地榆对VPAHPND的作用机理提供了基础。     

Vc对中国对虾非特异免疫因子及TLR/NF-κB表达量的影响

为了解Vc的免疫机制,以中国对虾为实验动物,对其投喂添加不同Vc含量(0%、0.5%、1%、2%)的饲料,进行存活率、iNOS、CAT、LZM酶活性及TLR、NF-κB表达水平的比较。结果发现:(1)饲喂Vc的不同处理组提高了中国对虾的存活率、iNOS、CAT及LZM活性,其中1%添加组存活率达90.28%,显著高于其他组。(2)Vc可以调节TLR、NF-κB在血清及鳃中的表达水平。1%添加组血清、鳃中TLR的表达水平相对于各自的对照组表现出显著性差异(P<0.05)。TLR、NF-κB在组织中的表达趋势并不一致。1%组血清中NF-κB的表达水平高于对照组,其他两组的表达水平始终位于对照组之下,而2%添加组鳃中的表达水平高于其他三组,说明Vc可以调节这两个免疫基因的表达,在中国对虾的免疫应答中发挥重要作用。     

黄芪多糖佐剂对大菱鲆五联疫苗免疫增效作用

用福尔马林灭活哈维氏弧菌、鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌、大菱鲆弧菌和溶藻胶弧菌制备成五联灭活疫苗,添加黄芪多糖作为佐剂。分别用添加黄芪多糖佐剂组和无佐剂组对大菱鲆进行腹腔注射,在第7、14、21、28、35、42、56天采取血样并检测抗体效价、溶菌酶活力和SOD活力,第56天进行人工攻毒实验,测定免疫保护力。结果表明,黄芪多糖佐剂组(免疫组2)和无佐剂组(免疫组1)两组的溶菌酶活力和SOD活力都在第28天达到最高值,且黄芪多糖佐剂组显著高于无佐剂组(P<0.05)。两个免疫组抗体效价也都在第28天达到最大值,但黄芪多糖佐剂组要显著高于无佐剂组(P<0.05),其中免疫组2的哈维氏弧菌、鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌、大菱鲆弧菌和溶藻胶弧菌的抗体效价分别为27.25、26.75、28.5、28.75、26.25,免疫组1分别为26、25.75、26.75、27.5、25。用上述5种细菌分别进行人工攻毒实验,结果表明,免疫组2的免疫保护力依次为50.0%、50.0%、71.4%、62.5%、44.4%;免疫组1的免疫保护力依次为37.5%、30.0%、42.9%、50.0%、33.3%。实验结果证明,五联疫苗对大菱鲆具有免疫作用,而且添加黄芪多糖佐剂组的免疫效果显著好于无佐剂组。     

投喂发酵饲料对刺参能量收支、生长、酶活性及其养殖水质的影响

为探究发酵饲料在刺参(Apostichopus japonicus)苗种培育中的效果,本研究测定了投喂发酵饲料对刺参苗种能量收支、生长、非特异性免疫酶和消化酶活性的影响,同时,对比分析了1个倒池周期内投喂发酵和未发酵饲料养殖单元池水的重要水质指标差异.结果表明,在50 d的养殖实验周期内,投喂发酵饲料组刺参苗种的存活率...     

刺参“参优1号”苗种在不同pH条件下的代谢特征和适应性研究

为研究刺参(Apostichopus japonicus)"参优1号"苗种的适宜pH及耐受范围并解析其对水体的酸碱性适应机制,本研究测定了pH 6.5~10.0条件下该良种苗种的生长、存活、呼吸代谢以及非特异性免疫酶活性的差异。结果显示,在pH 6.5~9.5范围内,30 d实验周期内苗种的存活率均为100%,而在pH 10.0条件下苗种全部死亡。在pH 7.5~8.5范围内,苗种特定生长率(SGR)为正值,且在pH为8.0时SGR最高,达到0.541%/d,而在pH低于7.0和高于9.0时,SGR为负值,苗种为负生长。对不同pH条件下的耗氧率(R_O)和排氨率(R_N)的测定结果显示,随pH的变化,R_O和R_N均呈现以pH 8.0为波谷的"V"型变化,在pH 8.0条件下的R_O和R_N分别为19.07和1.34μg/(g·h)。不同pH实验组刺参苗种的氧氮比(O/N)均在11左右,O/N随pH变化无显著差异(P>0.05)。pH的升高和降低会引起刺参体腔液中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶的活性显著升高(P<0.05),在苗种适应pH胁迫过程中,各pH组超氧化物歧化酶活性的峰值一般在第0天出现,而溶菌酶的活性峰值在第10天出现。研究表明,刺参"参优1号"可存活的pH范围为6.5~9.5,适宜生长的pH范围为7.5~8.5,pH变化会导致苗种呼吸代谢和免疫酶活性的改变。本研究结果将为刺参"参优1号"苗种的科学化推广提供依据。