小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系的建立

[目的]建立Toll样受体3(TLR3)基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据.[方法]采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)打靶载体pTALEN-TLR3,经酶切和测序验证其连接正确后,通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞,转染后提取细胞DNA,用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性.[结果]TALENs左右臂分两部分连接,首先完成A、B部分的各自连接,然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接,TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示,T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性,T2R有3个克隆呈阳性.T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板,经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切,酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强,共获得3条条带(931、555和376 bp).TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化,并加入800μg/mL G418进行筛选,7 d后获得细胞单克隆;挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序,结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系,均缺失7 bp的核苷酸碱基,为非3整数倍碱基缺失,可造成后续基因移码突变,使细胞基因功能失活.[结论]通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系,且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究.     

河沙改良土壤对烤烟生长及产质量的影响

为解决罗平地区部分植烟土壤板结、粘重问题,通过掺入河沙对烟叶农艺性状、产质量及主要化学成分指标的影响试验研究了土壤改良对烤烟生长及产质量的影响。结果表明：在土质较为粘重田地上,每个烟塘施用河沙2、3、4 kg处理的农艺性状较对照和施用河沙1 kg处理的要好,烟叶产量、产值、均价、上等烟比例也明显增高;每塘施用河沙3、4 kg能提高烟叶水溶性总糖、还原糖和K2O含量,降低烟碱含量,而塘施河沙1、2 kg处理对化学成分影响不明显。     

玉米孕穗期的管理要点

<正>孕穗期是玉米营养生长与生殖生长并进的时期,搞好这时期的田间管理,对于提高玉米产量起着至关重要的作用。其关键管理措施如下。 1、重施孕穗肥玉米孕穗期,是雌穗小穗、小花分化的盛期,是决定果     

4个多年生黑麦草品种对干旱胁迫的生理响应

为研究不同品种多年生黑麦草(Lolium perenne)的抗旱能力,选取4个多年生黑麦草品种,采用水培试验的方法,在温室利用PEG-6000模拟干旱胁迫,测定多年生黑麦草的草坪质量、地上部与地下部增长量、含水量、叶绿素含量以及抗氧化酶活性等生理指标。研究表明,干旱胁迫至10 d时,4个多年生黑麦草品种生长均受到明显抑制,同时4个品种的植株含水量都处于下降的趋势。此外,4个品种中超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶活性都出现了先上升后下降的趋势,丙二醛含量增加。利用隶属函数分析法进行抗旱性评价。结果表明,4种多年生黑麦草的抗旱能力强弱表现为Pr521>维达斯>百灵鸟>Pr525。     

集体土地产权制度改革问题探讨

我国农业生产力的发展水平很低,不能满足建立社会主义生产方式所要求的基础条件。主要表现为集体土地产权制度及其实现形式明显不适应农业生产力的发展水平。农业生产力的不断提高是农业和农村可持续发展的核心内容,因此,深化集体土地产权制度改革是促进农业可持续发展和农村发展的必要条件。     

一株粗糙型牛种布鲁氏菌诱导株的构建及鉴定

本试验旨在研究布鲁氏菌病疫苗的新型研制方法，并通过op诱导剂成功诱导出一株粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株，命名为RB71。试验检测了RB71相关基因的缺失情况，并对其脂多糖完整性、生长特性、遗传稳定性以及在小鼠巨噬细胞（RAW264.7）中生存能力等与光滑型菌株进行了比较研究。结果显示，试验成功获得了诱导突变株，其缺失片段大小为15 070 bp；热凝集试验阳性，能被结晶紫染色，吖啶黄凝集试验阳性；对提取脂多糖进行银染，结果显示O链缺失，诱导株RB71脂多糖不完整；连续传代30次，PCR检测未发现基因回复突变；在体外相同培养条件下，诱导株RB71生长速度显著低于亲本株A19；入侵RAW264.7细胞72 h时，其胞内存活率与亲本株相比极显著下降（P<0.01）。综上所述，本试验开发出一种能高效诱导光滑型布鲁氏菌变异为粗糙型布鲁氏菌的试剂及诱导方法，成功获得一株具有良好遗传稳定性的粗糙型减毒布鲁氏菌RB71诱导株，该诱导株在RAW264.7细胞内的存活能力显著变弱，这为新型弱毒布鲁氏菌粗糙型疫苗的研制奠定技术基础。     

广西部分地区猪群中猪链球菌分离株的毒力基因检测及毒力测定

为了解广西部分地区(玉林市、大新县、那坡县、东兴市、靖西市和百色市)猪群中猪链球菌(Streptococcus suis,SS)毒力基因的流行情况和毒力水平,试验采用PCR方法检测分离到的201株(经鉴定猪链球菌2&1/2型24株,猪链球菌7型2株,猪链球菌9型15株,一共41株)猪链球菌的毒力基因orf2、sly、ef和mrp,并通过斑马鱼模型筛选毒力较强的菌株,测定菌株的半数致死剂量(LD₅₀)。结果表明：从广西部分地区分离的201株猪链球菌的4种毒力基因携带率从高到低依次为orf2(85.6%,172/201)>sly(55.2%,111/201)>ef(33.8%,68/201)>mrp(26.4%,53/201);6个市县主要流行的毒力基因不同,玉林市、大新县、那坡县、东兴市、靖西市和百色市分离的猪链球菌携带最多的毒力基因分别为orf2(100%)、orf2(89.2%)、orf2(91.5%)、ef(44.4%)、orf2(86.7%)、orf2(40.0%);经鉴定分型的41株猪链球菌中,有7株(17.1%,7/41)同时携...