精子介导的转基因效率关键影响因素

【目的】精子介导的转基因技术简单易行,其作为制备转基因动物的一种方法已经被很多科学家所认同。但是不同实验室的研究结果显示其稳定性和重复性较低,转基因效率差异极大。现将主要探讨导致这种现象的原因。【方法】小鼠精子获能后分别与0、15、30和300nmol·L^-1 的Cy-3标记DNA（Cy-3-DNA）在37℃共孵育30 min。其后,血细胞计数板检测小鼠精子的活率;共孵育精子进行直接涂片,DPBS洗涤后涂片,DnaseI消化后涂片,精子涂片置于荧光显微镜下,记录视野中的精子总数及显示Cy-3信号的精子数,用于统计精子结合及内化DNA的效率。精子与300 nmol·L^-1 的Cy-3-DNA共孵育后,以50µmol·L^-1的 P₄诱导精子顶体反应,统计顶体反应前后显示Cy-3信号的精子比例。精子分别与15和300 nmol·L^-1 Cy-3-DNA共孵育后,精子进行体外受精,在荧光镜下观察合子期受精卵中Cy-3-DNA的存在位置。按照优化后的条件,精子分别与0、15和300 nmol·L^-1 pEGFP-C1质粒共孵育后进行体外受精,制备转基因胚胎。比较试验组和对照组的受精率和发育效率,采用PCR和RT-PCR方法检测囊胚期外源基因整合和表达情况。【结果】获能后的精子分别与0、3、15、30和300 nmol·L^-1的Cy-3-DNA共孵育后,精子的活率分别为82.21%、73.63%、77.38%、76.33%和77.80%;洗涤前精子结合DNA的效率分别为76%、94%、99%、100%,15、30和300 nmol·L^-1组精子结合率均显著高于3 nmol·L^-1组（P＜0.05）。洗涤后精子结合DNA的效率,分别为45%、66%、84%和87%,消化后精子内化DNA的效率分别为44%、56%、71%和76%,并且洗涤后精子结合及消化后精子内化DNA的效率都为300 nmol·L^-1组和30 nmol·L^-1组均显著高于其他两组,而15 nmol·L^-1组显著高于3 nmol·L^-1组（P＜0.05）;Image J对精子结合Cy-3-DNA的强度进行分析的结果表明,外源DNA的量随着外源DNA浓度的增加而显著增加（P＜0.01）。顶体反应后,精子顶体部DNA会有丢失,但精子头部后区的外源DNA依然会保留,因此,顶体反应前后,精子结合外源DNA的精子比率没有降低。15和300 nmol·L^-1 DNA共孵育的精子体外受精后,荧光显微镜下检测显示,合子期胚胎有外源DNA的荧光信号分布,将荧光信号在雄原核附近密集的胚胎记为阳性胚胎,300 nmol·L^-1 DNA共孵育的精子获得合子期胚胎的阳性率为27.89%,显著高于15 nmol·L^-1组的9.00%（P＜0.05）。精子与pEGFP-C1质粒共孵育后,体外受精,结果表明精子与DNA共孵育后,卵母细胞受精率及胚胎卵发育率与对照组相比差异不显著。单囊胚PCR检测15和300 nmol·L^-1的pEGFP-C1质粒与精子共孵育转基因胚胎阳性率分别为8.72%和21.50%;采用RT-PCR方法在300 nmol·L^-1组的囊胚中检测到了EGFP基因 RNA的表达,在荧光显微镜下没有观察到EGFP绿色荧光蛋白的表达。【结论】精子具备结合和内化外源DNA的能力,并能将外源DNA带入卵母细胞,顶体反应会使精子丢失顶体部DNA,但精子头部后区外源DNA依然保留。受精过程外源DNA在基因组中的整合及外源基因表达激活是精子介导转基因效率的关键影响因素。     

关于山东莱阳市畜牧业发展道路的探讨

畜牧业是国民经济的重要基础产业,加快发展畜牧业是调整优化农村经济结构,促使农业产业升级的重大战略举措,也是有效解决"三农"问题和建设社会主义新农村的重要途径。近几年来,莱阳市畜牧业取得了突破性发展,畜牧业科技进步步伐加快,产业结构不断优化,产业化经营快速推进,简单概括了莱阳市畜牧业发展情况并对莱阳市畜牧业发展道路进行了探讨。     

AquaCrop作物模型应用研究进展

Aqua Crop是FAO于2009年研发的一款新型作物模型,它以输入参数少、界面简单等优点被广泛应用于生产实践中。论文基于Aqua Crop模型原理和特点,深入探讨了Aqua Crop模型国内外应用研究进展。当前,Aqua Crop模型在灌溉策略、气候变化下的情景模拟以及与其他模型联合应用等方面取得了显著进展。但是,该模型在应用过程中还存在若干缺陷。一是模型在保守参数缺少验证的情况下,会使得模拟精度不稳定;二是由于土壤空间变异性的客观存在,模型在由点位向面上扩展时应用效果不佳;三是当前对雨养区作物生长模拟研究还很少,且其非保守参数难以准确确定;四是目前该模型生理、养分和水养互作模块尚不够完善,未考虑作物病虫害和品种遗传差异,当作物生长遭受水分、盐分或温度等严重胁迫时会导致模拟精度下降。今后在模型应用时,可利用多年数据对保守参数进行校正,将区域同一站点多年数据和多站点相关数据相结合调试模型非保守参数;其次,应加强雨养地区模拟研究,从而扩大模型应用范围。开发者应进一步完善Aqua Crop模型子模块,为提高模拟精度和拓宽应用范围提供支撑。     

长牡蛎与海豆芽外套膜细胞超微结构的比较观察

以软体动物中贝壳成分为碳酸钙的长牡蛎(Crassostrea gigas)和腕足动物中贝壳成分为磷酸钙的鸭嘴海豆芽(Lingula anatina)为研究对象,借助组织学和透射电镜方法,分别对两个物种外套膜边缘区域和中央区域的细胞进行超微结构观察,发现长牡蛎和鸭嘴海豆芽外套膜中的细胞类型均包含柱状表皮细胞、电子稠密粒细胞和电子透明粒细胞,但是两个物种的柱状表皮细胞类型以及分泌细胞的内含物各不相同。长牡蛎柱状表皮细胞包括3类,主要分布在外套膜边缘区域的A型、主要分布在外套膜中央区域的B型以及很少存在的C型,细胞大小为7～15μm。海豆芽柱状表皮细胞则分为A’型、B’型和C’型,细胞大小为10～15μm。两个物种的分泌细胞都包含电子稠密粒细胞和电子透明粒细胞,海豆芽还包括一类含有板层小体的特殊分泌细胞。上述结果在一定程度上可以解释两者贝壳组成成分的差异,从而为研究腕足动物和软体动物贝壳的形成机制和矿化作用提供借鉴。     

猪笼草叶笼滑移区各向异性超疏水润湿特性表征与机理分析

为获取各向异性超疏水表面研制的仿生原型,采用接触角测量仪测试表征了猪笼草(Nepenthes alata)叶笼滑移区的各向异性超疏水润湿特性,采用扫描电镜和三维形貌干涉仪观测滑移区形貌结构并提取三维特征信息,分析滑移区形貌结构对各向异性超疏水润湿特性的影响机理。结果表明:水滴在滑移区的接触角为(155.07±1.14)°,朝向叶笼底部和顶部的滚动角分别为(2.82±0.45)°和(5.40±0.31)°;滑移区覆盖着两端朝向叶笼内部弯曲且具有不对称凸面表层轮廓的微米级月骨体,以及形貌轮廓不规则且交错排列成致密孔洞结构的纳米级蜡质晶体,其中能够蓄留空气的蜡质晶体是产生超疏水润湿特性的重要因素;月骨体在不同方向的斜坡结构、悬崖结构致使水滴在滑移区滚动难易程度呈现差异,从而导致滚动角的显著不同与各向异性超疏水润湿现象的产生。     

微润灌溉线源入渗湿润体特性试验研究

为探明微润灌溉线源入渗水分运移规律,通过室内土箱试验对微润灌溉土壤水分分布进行研究,分析土壤质地和土壤密度对湿润体特性的影响。结果表明:微润灌溉湿润体是以微润带为轴心的柱状体,黏壤土为近似圆柱体,砂土湿润体横剖面为"倒梨"形,黏壤土R:X:H(R为水平运移距离,X为垂直向上运移距离,H为垂直向下运移距离)平均为1.00:0.90:0.99,砂土为1.00:0.81:0.95。湿润锋水平和垂直(向上和向下)运移距离均与灌水时间呈显著的幂函数关系,土壤密度和质地是影响湿润体特性的主要因素;微润带流量小,单位长度流量不超过210 mL/(m.h),可适应土壤含水率变化自动调整,累计入渗量与灌水时间呈线性关系;湿润体内含水率以微润管带为轴心呈同心圆面分布,大部分土壤含水率介于田间持水量的80%～90%之间,微润灌溉均匀度高,达95.62%。因此,微润灌溉技术节水效果显著,适宜旱区作物用水需求。     

富含γ-氨基丁酸降压功能稻米研究进展

γ-氨基丁酸(GABA)是一种神经抑制性递质的游离氨基酸,主要在稻米的胚部表达,具有平和血压和镇定神经等多种生理功能。本文综述了GABA在稻米中的分布与富集、富含GABA巨大胚水稻的诱变育种及其遗传表达特性、以及富含GABA功能稻米产品的研究进展。     

应用流式细胞术测定药用植物黄芩基因组大小

为了探讨和优化应用流式细胞术(FCM)测定药用植物的基因组大小（或称C值）的方法,本文分别以新鲜、幼嫩和硅胶干燥的叶片为材料,采用Otto和LB01两种细胞核提取液,利用流式细胞术对黄芩C值进行测定。结果表明,选用豌豆为内标植物时,相比LB01一步法,Otto两步法在低温提取、离心和保存条件下,碘化丙啶染色浓度为0.02 mg/mL,得到的细胞核散点图相对集中,碎片较少,容易准确取门,CV较小。不同提取材料表明,幼嫩叶片和新鲜叶片利用Otto二步法均能到高质量的细胞核悬液,细胞核数量多且散点图集中,有利于取门和测定的C值更准确。而干燥叶片提取的细胞核得到的散点图分散,无法准确取门和测定C值。最终,以黄芩为例系统地优化了利用流式细胞术测定药用植物基因组大小的方法,并首次成功测定黄芩1C值为0.58 pg,基因组大小约为562 Mbp,从而为了解物种的遗传背景和基因组值在系统演化中的变化规律,以及黄芩属药用植物资源的遗传评价和保护利用等方面的研究提供理论基础。     

基本农田立地条件指标体系构建与评价

立地条件是保障基本农田社会经济适宜性的重要条件,立地条件指标体系的构建必须准确反映区域耕地的利用水平以及与社会经济协调发展状况。据此,以东港市为例,通过文献综述法、归纳演绎法选取相互独立且反映县区耕地特征的典型敏感指标。为了表征耕地社会经济环境中对耕地生产力的作用和影响,从耕地用途稳定性和耕作便利性两方面构建了基本农田立地条件评价指标体系的结构框架,并讨论了指标的确定依据和评价指标赋值。     

豫南栗实象甲防治技术研究

栗实象甲在豫南地区的为害率高,普遍性严重。不同土壤质地、不同降雨年份、不同管理水平情况下栗实象甲为害状况不同。开展有针对性的栽培防治,结合物理防治,能在省工省时的同时达到快速、高效根除此虫的目的。