多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究

在转基因动物的研究中,一般采用随机插入的方法。基因在受体动物的基因组中随机整合,严重制约了转基因动物外源基因的稳定遗传,是转基因动物研究亟待解决的问题。转基因定点整合技术,即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径,但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小组已建立了体外动物细胞的多位点基因打靶技术,并构建了用于鳜鱼的体内多位点基因打靶的打靶载体,本文开展多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究。以鳜鱼rDNA基因(编码rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含干扰素基因的打靶载体,以其间隔序列为靶位点,针对鱼类胚胎发育特点,采用精子介导技术进行多位点基因打靶,最终获得定点整合干扰素基因的鳜鱼,并建立一套适用于动物的基因定点敲入的体内基因打靶技术。主要研究内容如下:(1)采用组织培养方法,获得鳜鱼头肾淋巴细胞和脾淋巴细胞,采用脂质体介导法使多位点基因打靶载体在鳜鱼的细胞上实行基因转移。采用正负筛选方法,利用筛选药物G418和GCV(更昔洛韦)筛选转染后的细胞两周后,对存活细胞进行DNA水平和RNA水平鉴定。结果证明了干扰素基因在鳜鱼细胞上实现了定点整合和稳定表达。(2)利用精子介导法将经线性化处理后的多位点基因打靶载体在鳜鱼的胚胎上实行基因转移。(3)根据靶位点定点整合的正负筛选原理,利用筛选药物G418和GCV筛选与富集定点整合后的阳性鱼胚或鱼苗,结果成功孵化出106尾转基因鳜鱼鱼苗。(4)培育6个月后,取20尾转基因鳜鱼进行鉴定。采用PCR、RT-PCR、测序等方法进行定点整合的鉴定。结果表明:6尾检测到已转入的基因——干扰素基因,其中有3尾实现了定点整合并表达。本研究率先将多位点基因打靶技术应用到转基因鱼的研究中,建立一套适用于鱼类的高效、安全的多位点基因打靶技术,并获得外源基因定点整合并表达的鳜鱼。     

7种防霉剂对烟仓霉变微生物的抑制作用及防霉效果的初步研究

测定了纳他霉素制剂等7种防霉剂对溜曲霉等10种引起广西仓储烟叶霉变的主要微生物的抑制作用,选出4种防霉剂进行了烟叶防霉试验。结果表明,在烟叶含水量为18%时,纳他霉素制剂2 000 m g/kg、富马酸二甲酯2 000 m g/kg和山梨酸钾2 000 m g/kg能有效抑制霉菌的生长繁殖,防止烟叶发霉。但在烟叶含水量为25%和35%时,防霉剂的防霉效果并不理想,这表明防霉剂的使用可以作为烟叶防霉的一种辅助手段。     

糠醛渣生态肥对风沙土理化性质和茄子效益的影响

采用田间试验方法,研究了糠醛渣生态肥对河西内陆灌区风沙土改土培肥效应和茄子效益的影响。结果表明:糠醛渣生态肥原料间的效应是:茄子专用肥糠醛渣5406生物菌肥,糠醛渣生态肥配方比例为:5406生物菌肥0.0103:茄子专用肥0.1291:糠醛渣0.8606。施用糠醛渣生态肥与传统化肥比较,风沙土体积质量、pH、EC和可溶性盐分别降低了13.85%、1.07%、6.22%和6.92%;Hg、Cd、Cr和Pb离子分别降低了21.21%、40.00%、18.70%和21.94%;总孔隙度、团聚体和饱和持水量分别增加了13.35%、16.98%和13.35%;CEC、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、有效锌和有效钼分别增加了19.20%、25.93%、0.29%、1.89%、0.17%、2.08%和8.33%;真菌、细菌和放线菌分别增加了59.00%、41.94%和24.32%;蔗糖酶、脲酶和磷酸酶分别增加了57.51%、5.88%和10.35%;茄子单果重、单株果重、产量和施肥利润分别增加了5.27%、5.35%、3.01%和0.51×104元/hm~2。糠醛渣生态肥施用量与风沙土总孔隙度、团聚体、饱和持水量、有机质、速效养分和茄子产量呈显著的正相关关系;与体积质量、pH呈显著的负相关关系;糠醛渣生态肥施用量与茄子产量间的线性回归方程为y=51.2300+1.5151x–0.0408x2,经济效益最佳施用量为17.40 t/hm~2,茄子理论产量为65.24 t/hm~2。在风沙土上施用糠醛渣生态肥,有效的改善了土壤理化性质和生物学性质,提高了土壤有机质和番茄产量。     

东北农牧交错带旱涝特征对气候变化的响应

[目的]从旱涝灾害角度分析气候变化对东北农牧交错带的影响,对该区的气候变化和旱涝特征进行研究,为充分利用气候资源,合理调配水资源,提高灾害应变能力提供科学依据。[方法]统计1960—2011年东北农牧交错带21个气象台站的逐月气温、降水资料,应用Mann—Kendall气候突变检验法、标准化降水指数(SPI)、样条函数插值法对该带旱涝状况的时空分布进行了分析。[结果](1)东北农牧交错带气候呈现出明显的暖干化趋势,SPI3表明春、夏、秋三季干旱事件增多,21世纪以来,春旱事件较为频繁,冬季降水略微增加;(2)气温突变发生在1988年,突变后,干旱的比例增加了20.7%,涝的比例增加了9.3%,降水处于"正常"的年份则大幅度减少,对该区极为不利;(3)SPI12低值中心由科尔沁沙地向东北延伸到松嫩平原,干旱面积有大幅度增加的趋势,东北农牧交错带中南部旱化较为严重。[结论]东北农牧交错带暖干化的趋势给该区农牧业带来不利影响,受旱地区应及时启动干旱预警紧急方案,开展抗旱工作。     

北京市边缘区土壤重金属污染的初步研究

基础资料为采集于北京城市边缘区的29个土壤剖面表层和底层58个样品6种重金属全量分析数据,以本区重金属自然土壤元素背景值作为评价标准,计算出各样点剖面表层和底层土壤单因子污染指数。应用对应因子分析手段, 初步揭示了北京市边缘区土壤重金属污染的空间分异特征。结果表明,北京市边缘区土壤重金属总体污染状况不明显,只有Hg元素属于轻微污染范围。不同样点间重金属污染水平比较显示,Hg污染水平差异明显,Pb、Cd、As、Zn、Cu污染差异不大。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的克隆、表达及其免疫原性

以本实验室分离的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型(Actinobacilluspleuropneumoniaeserotype2,APP-2)菌株HB08的基因组为模板,扩增了2871bp的APP毒素Ⅱ的结构基因apxIIA,并克隆到pET-28a原核表达载体中构建重组表达质粒pET28aIIA,转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3),经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,表达的重组蛋白具有良好的反应活性。将表达的蛋白经或不经复性处理,与纯化的天然毒素Ⅱ分别免疫昆明小鼠,同时设PBS空白对照组,每组12只,间隔2周免疫2次,采血检测其抗体效价,二免后2周用致死剂量的APP血清7型(APP-7)菌株(1.08×108CFU(菌落形成单位,colonyformunit)/只)腹腔攻击。结果显示,复性蛋白组的保护率为83.3%,非复性蛋白组的保护率为58.3%,天然毒素蛋白对照组保护率为91.7%,空白对照组小鼠全部死亡,说明复性的重组毒素Ⅱ具有良好的免疫原性。     

施钾对不同基因型棉花光合特性及产量和品质的影响

在田间条件下,研究了施钾对抗虫杂交棉中棉所38、抗虫棉新棉33B、常规棉中棉所12光合特性和产量及品质的影响。结果表明,与不施钾相比,不同基因型棉花施氯化钾225.kg/hm2,棉花叶面积指数(LAI),叶绿素荧光动力学参数PSⅡ最大光化学量子效率(Fv/Fm)、PSⅡ潜在光化学活性(Fv/Fo)、PSⅡ实际光化学效率(ФPSⅡ),叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs),棉花干物重及分配到生殖器官的比例,棉花总成铃数、铃重和衣分均有不同程度提高;中棉所38、新棉33B和中棉所12皮棉产量分别增加13.60%、10.66%和4.21%;棉纤维2.5%跨距长度、比强度、马克隆值和纤维整齐度等品质也得到改善。中棉所38和新棉33B比中棉所12施钾的效果更好,生产上应优先给抗虫杂交棉和抗虫棉品种施用钾肥。     

荷兰Groasis保水节水造林技术在民勤荒漠区的应用

[目的]研究荷兰Groasis(水盒子)在民勤荒漠区保水节水造林的初步应用,为荒漠区困难立地条件下进行大规模的节水造林和农业推广提供参考数据。[方法]选择了11种荒漠植物造林树种,在民勤沙区的退耕地、丘间地、引种圃3种类型的田间进行试验,测定成活率、土壤水分等。[结果](1)11种抗风沙树种在退耕地的土壤含水率的高低顺序为:沙拐枣花棒毛条柽柳沙地云杉樟子松胡杨蒙古扁桃沙棘榆树沙枣。(2)各种抗风沙树种在典型的3种土壤类型中,利用水盒子栽培的土壤含水率明显高于普通栽培的土壤,要高出2~5倍。(3)不同抗风沙树种和蔬菜利用水盒子在3种典型土壤类型中成活率比对照不同程度提高25%~70%左右。[结论]利用水盒子可以有效地提高抗风沙树种的成活率。     

樟树人工林生态系统的水分生态效应

对樟树人工林生态系统的大气降水、树干茎流、穿透水、林内地表径流、地下径流中N、P、SiO2、K、Ca、Mg、Cu、Fe、Zn、Mn共1O种养分元素含量进行了测定。结果表明：不同月份大气降水养分元素含量不同，各元素各月平均含量按大小排序为Ca〉SiO2〉Zn〉NH4-N〉K〉NO3-N〉Fe〉Mg〉Mn〉P〉Cu。大气降水经过林冠层后，树干茎流、林内穿透水中各养分元素含量变化基本一致，均表现季节动态变化．大多数元素含量增加。树干茎流中各元素含量按大小排序为K〉Ca〉NH4-N〉SiO2〉Mg〉NO3-N〉Zn〉Mn〉Fe〉P〉Cu；林内穿透水中各元素含量按大小排序为Ca〉K〉Zn〉SiO2〉NH4-N〉NO3-N〉Mg〉Mn〉Fe〉P〉Cu。树干茎流中SiO2、Fe、Zn，穿透水中Fe为负淋溶．其余各元素浓度有所增加，在这2项中，除NH4-N、K外，树干茎流中NO3-N、P、SiO2、Ca、Cu、Fe、Zn、Mn养分元素的富集作用均小于穿透水。     

氮肥、土壤湿度和温度对稻田土壤甲烷氧化的影响

Effects of nitrogen fertilizer,soil mosture and temperature and temperature on methane oxidation in paddy soil were investigated under laboratory conditions.Addition of 0.05 g N kg^-1 soil as NH4Cl strongly inhibited methane oxidation and addition of the same rate of KCl also inhibited the oxidation but with more slight effect,suggesting that the inhibitory effect was partly caused by increase in osmotic potential in microorganism cell,Not only NH4^ but also NO3^- greatly affected methane oxidation.Urea did not affect methane oxidation in paddy soil in the first two days of incubation,but strong inhibitory effect was observed afterwards.Methane was oxidized in the treated soil with an optimum moisture of 280 g kg^-1 ,and air-drying inhibited methane oxidation entirely.The optimum temperature of methane oxidation was about 30℃ in paddy soil.while no methane oxidation was observed at 5℃or 50℃。