猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究现状

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种对养猪业危害严重的传染病,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为有囊膜的单股正链RNA病毒,且具有高度的变异性,有美洲型和欧洲型两个血清型。猪肺泡巨噬细胞(PAM)、恒河猴胎肾细胞系MA-104及源于MA-104的传代细胞系(如Marc-145、CL-2621、HS.2H和CRL-1171)对PRRSV敏感。预防该病的常规疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗两种。通常以特定种毒在适当细胞系中培养增殖,经灭活或致弱,加入佐剂制得相应疫苗。灭活疫苗交叉保护性差,但使用安全;弱毒疫苗抗体产生快、持续时间长、保护力强,但源毒能在猪群中持续存在而有安全隐患。     

天祝白牦牛肾组织成纤维细胞系的建立与生物学特性研究

采集天祝白牦牛胚胎肾组织,用胰蛋白酶热消化法制备原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法继代培养和细胞纯化,扩增至F3代后冷冻保存,并对复苏细胞的形态、活力、生长曲线、荧光蛋白质粒转染表达、核型以及乳酸脱氢酶同工酶等生物学特性进行了分析。结果显示,原代和传代细胞生长形态良好,群体倍增时间为27.2 h;染色体2n=60;二倍体为74%,占主体;乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱有明显特征,LDH5浓度较高,活性较强;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性。表明本研究已成功建立天祝白牦牛肾组织成纤维细胞系,该细胞系的建立,使天祝白牦牛这一国家重要种质资源在细胞水平上得以保存,也为基因组文库和体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料。     

兰州百合组培快繁体系的构建

以兰州百合新鲜鳞茎为外植体,选择MS和1/2 MS培养基为基本培养基,采用正交设计研究不同消毒剂组合对外植体存活率、不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导率和发芽率的影响;并用响应面法优化不同激素组合对生根率的影响。结果表明:(1)最佳消毒剂组合为75%乙醇消毒20 s+2%次氯酸钠溶液浸泡10 min,外植体成活率可达96.30%。(2)愈伤组织诱导最佳培养基配方为MS+0.3 mg·L^-1 NAA+3 mg·L^-1 6-BA,诱导率可达96.33%。(3)促进发芽的最佳培养基配方为MS+0.3 mg·L^-1 NAA+3 mg·L^-1 6-BA,发芽率可达98.00%。(4)促进生根的最佳培养基配方为1/2 MS+0.5 mg·L^-1 NAA+3 mg·L^-1 6-BA+2 mg·L^-1活性炭,生根率可达94.00%。本研究建立的组培快繁体系可用于兰州百合的快速大量繁殖,可为兰州百合组培苗的工厂化生产提供参考。     

PK15细胞的生物学特性和质量评价研究

为评价PK15细胞能否用于兽用疫苗的研究和生产,对其进行了生物学特性研究和微生物污染及病毒外源因子检测。结果表明:PK15细胞复苏活力为91.77%,呈贴壁性生长,形态为上皮型;生长曲线呈"S"型,最大增殖浓度为24.67×104个·mL-1,群体倍增时间为21.08h;同工酶为5条,染色体2n=38,证实为猪源性且没有发生细胞间的交叉污染;细菌、真菌和支原体检查均为阴性;细胞体外培养观察、血吸附试验、接种鸡胚和动物以及特异性荧光抗体结合物检查病毒均为阴性;能较好地表达外源基因,达到了兽用疫苗生产用细胞的质量要求,可为以该细胞为基质的疫苗研究和生产提供细胞资源。     

牦牛转铁蛋白对LPS诱生小鼠巨噬细胞脂质过氧化的影响

用LPS诱生小鼠腹腔巨噬细胞发生脂质过氧化，观察牦牛血清中分离纯化的转铁蛋白对其脂质过氧化的影响。结果表明：LPS终浓度为20μg／ml、培养时间12h时，LPS诱生小鼠腹腔巨噬细胞产生丙二醛的量显著增加，且满足实验需要。当添加不同浓度牦牛血清转铁蛋白后，丙二醛受到显著抑制，谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高且呈现剂量依赖性，但超氧化物歧化酶活性均无明显影响。提示，牦牛血清转铁蛋白具有更好的抑制脂质过氧化和提高谷胱甘肽过氧化物酶的作用。抑制脂质过氧化生成和提高谷胱甘肽过氧化物酶的作用，可能是转铁蛋白抑制细菌、抗病毒、保护与促进细胞生长等功能的作用机制之一。     

猪脑心肌炎病毒RT-PCR检测方法的建立

为了对猪脑心肌炎病毒(EMCV)进行血清学调查和临床检测,试验根据猪脑心肌炎病毒5'端结构蛋白VP2基因序列设计、合成1对特异性引物,建立检测猪脑心肌炎病毒385 bp片段的RT-PCR检测方法。结果表明:该方法对脑心肌炎标准毒株VR-129B(GenBank登录号为X74312)的检测结果为阳性,对标准毒株的细胞培养物检测的敏感度达0.1TCID50;而对猪乙型脑炎病毒、戊型肝炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒的检测结果为阴性。说明该方法特异性强、灵敏性高,可以用于猪脑心肌炎病毒的检测和早期诊断。     

β-丙内酯对脑心肌炎病毒灭活效果的试验

通过研究β-丙内酯(BPL)对脑心肌炎病毒(EMCV)灭活效果以及优化灭活条件,为制备脑心肌炎诊断试剂和疫苗提供参考依据.用终浓度分别为1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000等的β-丙内酯灭活103 TCID50滴度猪脑心肌炎病毒,采用4℃灭活4 h、8h、12h后37℃C 2h,并将灭活后的病毒接种敏感细胞VREO上观察细胞病变(CPE)情况,选择未出现CPE的细胞孔盲传3代后,采用ELISA和PCR的方法观察灭活效果.结果显示:BPL浓度和反应时间与灭活效果存在明显的线性关系,但BPL浓度越高抗原性下降幅度越大,RT-PCR未有扩增,说明BPL可以用于EMCV的灭活,且根据试验结果优选灭活条件为BPL浓度为1∶2 000,4℃灭活8h为最佳.结论表明:BPL完全可以用来灭活EMCV,为今后开发灭活疫苗或诊断试剂的生物安全性提供了保证.     

连片池塘成鱼养殖高产技术试验

为了摸索连片池塘成鱼养殖高产综合技术措施，促进稳产高产，我们于1982年在东沟县北井子大队渔场进行了高产技术试验。     

胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白工艺研究

为进一步利用血液资源,以藏羊血清为原料,采用胃蛋白酶对其进行水解。以水解度为指标,研究pH、温度、加酶量3个因素对藏羊血清水解度的影响规律;在此基础上,采用Box-Benhnken响应面试验优化胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白工艺条件。结果表明：底物浓度为5%、加酶量为6 200 U时,最佳水解条件：温度为46℃、pH为2.25、酶解时间2 h,水解度为(23.41±0.23)%。