猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ N端基因的克隆、抗原表位的分析及表达

参照猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）ApxⅣ基因序列（AF021919）,从临床分离株2009JH扩增出1段2 427bp的序列,应用DNAstar等软件进行了序列分析和抗原表位的预测,利用PCR扩增了包含预测抗原位点的3个片段,ApxⅣ1（1～1 503bp）、ApxⅣ2（1 051～2 427bp）、ApxⅣ3（1 051～1 503bp）,并构建了原核表达载体pET-ApxⅣ1,pET-ApxⅣ2,pET-ApxⅣ3。将重组表达质粒转入E.coli BL21,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot检测。结果显示,2009JH分离株ApxⅣN端序列与参考序列（AF021919）的同源性为98.00%,与血清1型、2型和7型的同源性分别为98.23%,99.46%,98.06%。3个片段的重组质粒分别诱导表达出相对分子质量为55 000,50 000,20 000的蛋白,Western blot检测显示除20 000蛋白未检测到特异性条带外,其余有很好的反应原性。     

单增李斯特菌lmo2193基因克隆与原核表达

为了对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2193基因进行克隆及其原核表达,采用PCR方法扩增lmo2193基因,连接pMD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。将目的基因克隆至原核表达质粒p ET32a中,构建重组质粒pET32a-2193,并转化大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达后,利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。结果显示:扩增得到的lmo2193基因序列长度为1 077 bp,与预期一致;该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE检测和Western blot鉴定分析表明该产物为1个60 ku左右的融合重组蛋白。本研究成功克隆lmo2193基因,并获得大量表达,为进一步研究lmo2193基因功能奠定基础。     

原代犬小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立原代犬小肠上皮细胞分离培养及纯化的方法,为犬肠道病毒性、细菌性及寄生虫相关疾病研究提供细胞材料。采用组织块培养法分离培养原代犬小肠上皮细胞,胰酶差速消化法进行纯化,利用细胞形态学、间接免疫荧光法鉴定上皮细胞特性,脂多糖(LPS)刺激原代上皮细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测炎性因子转录水平,鉴定原代犬小肠上皮细胞的功能。结果显示：组织块培养法获得的原代犬小肠上皮细胞可在24 h内贴壁,第3天细胞开始增殖,第4天时达到增殖顶峰,第5～7天细胞活性逐渐降低,在体外连续传代可培养至第10代。经胰蛋白酶差速消化纯化后,获得铺路石样原代犬小肠上皮细胞,生长曲线类似“S”形,上皮细胞特异性细胞角蛋白18 (CK18)鉴定呈阳性,LPS可诱导犬小肠原代上皮细胞炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的转录水平在12 h(P<0.05)、24 h(P<0.01)表达量呈显著和极显著差异。研究表明,利用组织块培养法可成功分离获得数量较多、纯度较高且具有典型上皮细胞形态和功能的犬小肠上皮细...     

猪流感病毒多表位抗原的小鼠黏膜免疫试验

为探讨经黏膜途径免疫接种猪流感病毒(SIV)多肽疫苗的可行性,选择STV主要结构蛋白血凝素(HA)的T、B抗原表位,将多个表位片段串联,定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,对串联表达的重组猪流感病毒蛋白SIV-ep1、SW-ep2、SIV-el2进行了小鼠免疫试验。重组蛋白以包涵体形式表达,经洗涤定量后,采用灌胃途径免疫6周龄KM小鼠,检测免疫小鼠抗体及细胞免疫水平。结果发现三免后各免疫组血清IgG抗体与PBS对照组差异极显著(P<0.01);黏膜分泌型IgA抗体,所有免疫蛋白组与PBS组差异均极显著(P<0.01);细胞免疫检测,所有免疫组小鼠外周血T淋巴细胞增殖明显;猪流感病毒血凝抗体检测,SIV-ep1免疫组、SIV-ep2免疫组、SIV-ep1与LT蛋白免疫组抗SIVH1N1亚型HI效价达1:1024,SIV-el2蛋白免疫组HI效价达1:512。结果表明,猪流感病毒重组多表位抗原灌胃免疫小鼠,能产生理想的黏膜免疫抗体和血清抗体。     

致犊牛腹泻大肠杆菌对小鼠致病性及药物敏感性试验

为探讨近年来新疆地区犊牛腹泻的发病原因,于2009年4月至2010年8月,对新疆地区部分集约化奶牛场110头严重腹泻犊牛及11头病死犊牛进行病料采集,从121份病样中分离出102株大肠杆菌;分离菌株进行小鼠腹腔注射均能造成小鼠发病,LD50从3.7768×108到1.888×107之间;所分离的大肠杆菌对氨苄西林、复方新诺明、庆大霉素、氯霉素、环丙沙星敏感性分别为22.5%、30.4%、40.2%、41.2%、46.1%,对阿米卡星、头孢噻吩、头孢孟多、头孢他啶、头孢西叮的敏感性分别为70.6%、75.5%、84.3%、98%、100.0%。表明新疆地区近两年来犊牛腹泻主要是由致病性大肠杆菌引起,其对头孢西叮敏感性较高,对其它抗生素均率产生不同程度的耐药性。