猪圆环病毒1型和2型a与b基因型三重PCR鉴别方法的建立及应用

根据PCV-1、PCV-2a和PCV-2b差异序列,设计了3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可以用于PCV检测及PCV-1、PCV-2a和PCV-2b分型的PCR方法。结果表明,三重PCR检测的最低敏感度可达4.87×107 copies/μL(PCV-1)、2.83×107 copies/μL(PCV-2a)和2.96×106 copies/μL(PCV-2b)。引物特异性良好,各引物之间没有交叉反应,对伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)检测均为阴性。应用该方法对采自陕西省的56份样品进行检测,PCV-1检出率57.14%(32/56),PCV-2a检出率1.78%(1/56),PCV-2b检出率42.86%(24/56),多重PCR检测结果与单PCR检测结果的符合率达99%以上,可用于猪圆环病毒的临床检测及流行病学监测等。     

中华鳖脾淋巴细胞体外转化的实验条件研究

为确定MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测中华鳖脾淋巴细胞体外转化的条件,对脾淋巴细胞浓度和培养时间、丝裂原种类和浓度等影响因素进行优化.结果显示:2×106 cells.mL-1的脾淋巴细胞用10μg·mL-1Con A(伴刀豆蛋白A)诱导培养120 h或用5μg.mL-1 PHA(植物血凝素)诱导培养144 h,能获得良好的检测效果.研究表明,采用MTT法测定中华鳖脾淋巴细胞体外转化方便可行,可为中华鳖脾淋巴细胞体外转化方面的研究提供参考.     

菊花耐寒特性分析及其评价指标的确定

 【目的】低温是影响菊花生长的主要环境因子之一,从生理、形态解剖等水平对菊花耐寒特性进行研究,并探讨各耐寒指标之间的关系,建立可靠的菊花耐寒性数学评价模型,为菊花耐寒种质的挖掘、耐寒性新品种选育及大规模菊花品种的耐寒评价奠定基础。【方法】对6个菊花品种在低温处理下的脚芽叶片的SOD酶、CAT酶、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白等生理指标以及解剖结构特征的分析,结合相关性检验,筛选与耐寒性密切相关的指标。运用主成分分析、回归分析、聚类分析和通径分析方法,对筛选指标进行综合分析。【结果】对14个与耐寒性有关的指标进行了分析,结果发现菊花半致死温度（LT50）与-14～-17℃的SOD变化率、-11～-14℃的可溶性糖变化率（SS1）、栅栏组织厚度（L2）和上表皮厚度（L4）、栅/海比（L6）、栅栏组织紧密度（L7）呈极显著负相关（P＜0.01）,与栅栏组织疏松度（L8）呈显著正相关。【结论】提炼出4个指标并建立了菊花耐寒性评价的数学模型：Y=16.370-0.029SS1-0.075L7-0.314L8-12.250L6（R2=1.000）,预测精度大于94%。     

猪转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响

无菌采取犬抗凝血,分离淋巴细胞并制备成不同浓度.应用正交试验,探讨不同浓度淋巴细胞、植物血凝素(PHA-p)、犊牛血清(FCS)对淋巴细胞增殖的影响.在此基础上,研究不同浓度猪转移因子(transfer factor,TF)对犬淋巴细胞增殖的影响,增殖的结果用MTT法测定.试验结果表明,当犬淋巴细胞浓度为5×106个/ml,PHA-P为12.5μg/ml,FCS为10%时,淋巴细胞增殖效果最佳.在最佳培养条件下,猪TF浓度在0.195～25mg/ml时,对淋巴细胞转化增殖均有明显促进作用,猪TF单独或与PHA-P共同作用时对淋巴细胞增殖的最佳刺激浓度均为1.56mg/ml,且猪TF单独作用于淋巴细胞的效果优于与PHA-P的协同作用.试验结果证实,异源TF对犬淋巴细胞增殖有良好的刺激效果,同时本研究结果为异源TF在临床上应用于犬病毒性疾病的防治提供了试验依据.     

山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、 序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的GTPV基因组序列,设计并合成1对特异性引物,以GTPV疫苗株基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF103基因片段并进行序列分析,再将该基因片段亚克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-ORF103,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDSPAGE和Western blot检测。成功克隆GTPV疫苗株ORF103基因片段。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为35ku的重组蛋白,该蛋白能与山羊痘阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为GTPV的分子生物学特性研究提供资料,并为进一步研制GTPV抗体检测试剂盒奠定基础。     

经猪血管内皮细胞多次传代的CSFV E2基因的遗传变异研究

【目的】研究猪瘟病毒(CSFV)E2基因在猪脐静脉血管内皮细胞中多次传代后的遗传变异情况,为CSFV的致病机理研究提供理论依据。【方法】分离并培养猪脐静脉血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株脾毒后继续培养,染毒细胞经3次连续传代后全部死亡、脱落,收集每代细胞并提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增CSFVE2基因。将获得的目的基因克隆入T载体并转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒,进行PCR和BamHⅠ、HindⅢ酶切鉴定,将阳性的重组质粒进行测序,并用DNAStar软件进行序列分析。【结果】扩增出了E2基因,重组质粒PMD18-T-E2的PCR和双酶切鉴定结果表明,E2基因与pMD18-T载体连接成功。各代猪脐静脉血管内皮细胞中CSFVE2基因之间的核苷酸序列同源性为99.4%~99.9%,氨基酸序列同源性为98.9%~99.8%;各代猪脐静脉血管内皮细胞中的CSFVE2基因与标准病毒石门株之间的核苷酸序列同源性为98.9%~99.3%,氨基酸序列同源性为98.9%~99.2%。【结论】猪瘟病毒石门株在猪血管内皮细胞上传代的过程中E2基因无明显的变异,能保持遗传的稳定性。     

整合素β1和β2亚基胞内区的原核高效表达及纯化

【目的】构建整合素(Integrin)β1和β2亚基胞内区原核表达载体,高效表达整合素β1和β2亚基胞内区蛋白,为进一步研究其在细胞迁移和信号传导中的定位及其多克隆抗体的制备奠定了基础。【方法】采用PCR技术,从cDNA中扩增出整合素β1和β2亚基胞内区基因片断,并将其克隆到pGEX-4T2原核表达载体上,构建了GST-β1和GST-β2质粒,然后将GST-β1和GST-β2质粒分别转化E.coliBL21(DE3)表达菌,用IPTG诱导,成功表达了整合素β1和β2亚基胞内区蛋白,并利用Glutathione SepharoseTM4B对表达产物进行纯化。【结果】利用PCR扩增得到了整合素β1和β2亚基胞内区基因片段,并成功构建了GST-β1和GST-β2质粒;对GST-β1和GST-β2诱导表达发现,这2种融合蛋白均为可溶性蛋白,具有良好的生物学活性。通过纯化得到了高纯度的GST-β1和GST-β2融合蛋白。【结论】整合素β1和β2亚基胞内区基因可以高效表达,并具有良好的生物学活性。     

中草药对奶牛乳房炎病原菌的体外抑菌作用

[目的]寻找治疗奶牛乳房炎的新途径。[方法]选择常用7味中草药煎剂及5种复方制剂,采用试管二倍稀释法,对从患隐性乳房炎奶牛的乳汁中所分离的5种致病菌进行抑菌试验,并测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。[结果]结果表明:野菊花、黄连、大青叶、复方Ⅰ及复方Ⅴ对这5种病原菌均具有较强的体外抗菌活性。[结论]该研究为研制防治奶牛乳腺炎中草药制剂的科学组方提供了理论依据。     

鸡胚成纤维细胞与鸡气管黏膜上皮细胞共培养体系的建立

【目的】建立鸡气管黏膜上皮细胞(Chicken trachea epithelium cells,CTECs)和鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEFs)共培养体系,为CTECs体外培养研究与应用奠定基础。【方法】利用细胞套皿培养方法,使CEFs与CTECs体外共培养在一个营养体系中,用含有不同促细胞生长因子(氢化可的松(HC)、转铁蛋白(TF)、人表皮生长因子(HEGF)或牛垂体提取物(BPE))和血清(胎牛血清、鸡血清)的培养液培养,观察各组CTECs的生长情况,绘制生长曲线,记录CTECs体外生长增殖的特点。【结果】与单独培养的CTECs相比,共培养体系中的CTECs体外贴壁、生长增殖能力均显著提高,72h能够铺满整个培养皿,并呈典型的上皮细胞"铺路石"状排列。共培养体系中的CTECs,在缺少3种重要哺乳动物气管黏膜上皮细胞培养所需的促细胞生长因子培养液中,仍能保持较好的生长能力,大大降低了CTECs的培养成本。【结论】成功建立了CTECs与CEFs的共培养体系,为CTECs的体外培养和应用提供了技术支持。