海豚链球菌兼职蛋白FBA的克隆表达、抗原性检测及免疫效果评价

为检测斑点叉尾鮰源海豚链球菌兼职蛋白(fructose-1,6-bisphosphate aldolases,FBA)的抗原性和潜在的疫苗价值,本实验克隆得到斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09(基因组登陆号LXQF01)的fba基因序列(基因登录号A7N10_RS06935),对克隆序列进行生物信息学分析,并通过原核表达得到重组FBA蛋白(r FBA),制备了兔抗r FBA血清用于FBA蛋白抗原性检测,同时通过免疫保护实验评估重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,海豚链球菌DX09 fba基因有1个882 bp的开放阅读框(ORF),编码293个氨基酸。生物信息学分析显示,其分子式为C_(1378)H_(2172)N_(368)O_(422)S_8,分子质量为30.9 ku,理论等电点为5.01,不具有信号肽和跨膜区域;具有保守的裂解酶结构域,且与其他来源的FBA蛋白同源性达100%;具有较高的抗原指数,表明其可形成多个抗原表位。SDS-PAGE检测发现,诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中,大小约为47 ku。Western blot分析表明,兔抗r FBA血清能特异性结合菌体蛋白。同时免疫保护实验显示,重组蛋白对斑点叉尾鮰的相对保护率可达55%,免疫后鱼体抗体水平相对对照组显著升高。本研究表明,原核表达的斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09 rFBA具备较好的抗原性和免疫保护作用,具有研发斑点叉尾鮰海豚链球菌亚单位疫苗的潜在价值。     

莆大麦7号高产高效优化栽培技术研究

采用五因素二次回归正交旋转组合设计试验方法,对大麦新品种莆大麦7号的主要栽培措施与产量及效益间的量化关系进行系统研究,通过时建立的产量度效益数学模型的优化与解析,以明确影响莆大麦7号产量及效益的关键因子和实现高产高效优化栽培的综合农艺措施。结果表明,在5个因素中,对莆大麦7号的影响为施氮总量〉基本苗〉K20〉P205〉施N比例;要获得300～350kg／666．7m^2的产量和385元／666．7m^2以上的经济效益,其最佳栽培措施组合是：保持基本苗14．92万～16．12万／666.7m^2,施纯N16．19～17．04kg／666．7m^2,其中基施纯N比例为58．1％～61．3％,P2O5 3．43～4．10kg／666．7m^2,K2O 6.67～7．75kg／666．7m^2．     

维里纳气单胞菌致泥鳅溃疡病的病理学观察

从自然发病的泥鳅体内分离鉴定的病原菌维里纳气单胞菌(Aeromonas veronii)感染健康泥鳅,对发病泥鳅进行系统的病理学观察.病变以体表充血、出血和溃疡为特征,伴有腹部肿胀、肛门红肿外突等症状.剖解可见肝、脾、.肾等内脏器官充血、肿大.病理组织学上,表皮坏死、脱落、崩解,真皮和皮下组织炎性水肿,肌纤维肿胀、变性、坏死、溶解;肝细胞水泡变性和坏死,肠道上皮细胞变性、坏死、脱落,固有膜、粘膜下层水肿、增厚;心脏外膜增厚,疏松水肿,有较多的炎性细胞浸润;脾组织离散,血管扩张、充血,有明显出血,大量含铁血黄素沉着;肾组织发生严重炎性水肿,组织间隙增宽,肾小管上皮细胞肿胀,变性.超微结构上,肝细胞内线粒体肿胀呈囊泡状,嵴溶解消失,内质网扩张,脱核糖体颗粒;肌细胞核固缩、坏死,电子密度增大,肌纤维z线弯曲,M线不清.     

一株鲈鲤源鲤春病毒血症病毒的分离鉴定及其病理观察

2016年4月,四川某鲈鲤(Percocypris pingi)养殖场流行一种以鳃、鱼鳔和内脏器官出血为临床特征的传染病。组织病理学观察发现,患病鲈鲤全身多组织器官均发生明显的病理损伤,尤其是肝、脾、肾、鳃和肠表现为明显的出血、变性、坏死以及炎症细胞浸润。取病鱼组织匀浆滤液接种鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprini, EPC),盲传3代出现典型的细胞病变(cytopathic effects, CPE)。将自然发病鱼组织匀浆滤液和细胞培养病毒液分别接种健康鲈鲤,实验鱼出现与自然发病鱼相同的症状,死亡率分别为60%和50%,而对照组未见异常。对经分离毒株ZLP160415感染出现CPE的EPC细胞制备超薄切片进行电镜观察,发现病毒呈弹状,长90～150 nm,宽40～60 nm;对自然发病鱼、人工感染发病鱼内脏组织和细胞培养病毒液进行鲤春病毒血症病毒(springviremiaofcarpvirus,SVCV)的RT-PCR检测,均扩增出目的条带。基于SVCV糖蛋白基因进行系统发育分析,结果显示分离毒株(ZLP160415)属于Ia型。结合本次疾病的流行病学与病理损伤特点、病毒分离鉴定、人工感染试验结果和透射电镜检查,确定此次流行病的病原为SVCV。     

响应面法优化爱德华菌口服微球疫苗制备工艺及其特性分析

为优化渔用口服微球疫苗制备工艺,实验以海藻酸钠及爱德华菌灭活疫苗为原材料,采用乳化离子交联法制备爱德华菌口服微球疫苗。通过单因素实验研究海藻酸钠浓度、水油相比例、乳化剂浓度以及乳化时间对微球疫苗包封效率的影响,根据Box-Behnken中心组合实验设计,采用4因素3水平响应面法优化爱德华菌海藻酸钠微球疫苗的制备工艺。结果表明最佳制备工艺条件为海藻酸钠浓度3.5%,水油相比例2.4∶7.6,乳化剂浓度5.4%,乳化时间13 min。研究表明,在最佳工艺条件下制备的爱德华菌口服微球疫苗成球性好,粒径分布均匀,粒径(8.88±1.26)μm,跨距0.38,包封效率96.37%,具有较好抗酸性、肠溶性以及高安全性的特点。     

罗非鱼源无乳链球菌兼职蛋白EF-Tu的克隆、表达及其抗原性检测

为检测罗非鱼源无乳链球菌兼职蛋白EF-Tu(延伸因子Tu,Elongation Factor Tu)的抗原性,本实验克隆了罗非鱼源无乳链球菌HN0303的EF-Tu基因序列,并进行了蛋白相关性质的预测和系统发育树的构建。通过原核表达得到EF-Tu重组蛋白,同时利用纯化的蛋白免疫家兔获得多克隆兔抗EF-Tu重组蛋白血清以用于EF-Tu蛋白抗原性检测。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌HN0303 EF-Tu基因有1个由1197个碱基组成的ORF,编码398个氨基酸。生物信息学分析显示其分子式为C_(1933)H_(3096)N_(532)O_(615)S_(11),分子质量为43.981 ku,理论等电点为4.749;具有多个磷酸化位点,不具有信号肽和跨膜区域;具有保守的EFTu结构域、EF-Tu-II结构域和EF-Tu-Ⅲ结构域,且与其他来源无乳链球菌的EF-Tu蛋白具有很高的同源性;具有较高的抗原指数,表明其可形成多个抗原表位。SDS-PAGE检测发现,诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中,大小约为66.4 ku。Western Blot分析表明,兔抗EF-Tu重组蛋白血清能分别特异性结合菌体蛋白和EF-Tu重组蛋白。同时使用兔抗EF-Tu重组蛋白血清封闭罗非鱼源无乳链球菌HN0303表面的EF-Tu蛋白后,无乳链球菌HN0303粘附EPC(Epithelioma papulosum cyprini,鲤鱼上皮细胞)的能力下降了79.99%±2.43%。本研究表明,原核表达的罗非鱼源无乳链球菌EF-Tu重组蛋白具备较好的抗原性,用其制备的兔抗血清能够较好地抑制罗非鱼源无乳链球菌的粘附,推测其可能为罗非鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的候选蛋白。     

四川地区养殖鲫鲤疱疹病毒Ⅱ型的鉴定及病理学研究

为探究疾病病因和流行特点,对患病鲫进行剖检、病理学观察、分子生物学检测及人工感染实验。结果显示,患病鲫临床表现为离群独游、浮头、全身发黑及体表出血等。剖检发现鳃、肝脏、肾脏等器官出血、肿胀和坏死,鳔点状出血。组织病理观察显示,鳃呼吸上皮细胞肿胀、坏死及脱落;肾脏局灶性坏死;脾脏组织广泛变性坏死,造血系统崩解;肝脏发生空泡变性和坏死。透射电镜观察到脾脏和肾脏中存在4种大小不同的病毒颗粒,分别为DNA病毒内核、空衣壳、实心衣壳和有包膜的成熟病毒粒子。未成熟的病毒粒子存在于细胞核,成熟的病毒粒子存在于细胞质。电镜下可见鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)在细胞核内完成核酸复制和核衣壳装配,囊膜蛋白在出核后获得。细胞核萎缩、核染色质边缘化,线粒体肿胀、坏死、嵴断裂,细胞质空泡化。取患病鲫组织匀浆滤菌后接种到鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprinid cell line,EPC)和胖头鲤肌肉细胞系(fathead minnow cell line, FHM),盲传3代后未见细胞病变。通过腹腔注射患病鲫组织匀浆进行人工感染实验,实验组鲫表现出与自然感染鲫相同的临床症状,对照组鲫正常,实验组累积死亡率为80%。用PCR方法检测CyHV-2的解旋酶基因片段,扩增出预期大小相符的目的条带。利用邻近法对该病毒的解旋酶基因进行系统发育分析,结果显示与CyHV-2(YZ-01)的同源性为99%。以上实验结果证实了CyHV-2是导致这次疾病暴发的原因。     

斑点叉尾鮰肠套叠症和肠型败血症的诊断及防治

斑点叉尾鮰肠套叠症是一种高发病和高致死的传染性疾病,为了对斑点叉尾鮰肠套叠症与危害大、死亡率高的斑点叉尾鮰肠道败血症进行鉴别诊断,以达到生产上有效区分并防治这两种细菌性疾病的目的,从病原学、流行病学、主要症状、耐药性和病原鉴定等方面进行了比较分析,从而阐明以上两种鲴鱼疾病的诊断方法和防治措施.     

土层置换对不同作物根际土壤酶及土壤养分的影响

为研究土层置换犁改良土壤后对不同作物根际土壤酶活性及土壤养分含量的影响,分别于6月、8月、10月对作物根际土壤过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶采用常规方法进行测定,并于作物成熟期对土壤养分含量进行测定。结果表明,土层置换可降低3种作物根际土壤过氧化氢酶,脲酶及蔗糖酶活性,3种作物随生育进程过氧化氢酶,脲酶活性变化趋势相同;而蔗糖酶变化趋势不同,大豆根系土壤蔗糖酶随生育进程表现为持续升高,马铃薯和甜菜根系土壤蔗糖酶是先升高后降低;土层置换处理降低了作物根际土壤养分含量的同时对土壤pH有一定影响;土层置换可增加作物产量,与对照相比大豆增产幅度达到20.14%,马铃薯25.00%、甜菜38.89%。因此,土层置换改变了土壤土体结构的同时,可全面活化土壤养分,改变土壤酶活性,对于提高作物产量具有重要作用。     

氮磷钾对阔叶十大功劳生长的影响

采用田间小区试验方法,研究了氮、磷、钾肥对阔叶十大功劳生长的影响。结果表明,氮、磷、钾肥不同配比对阔叶十大功劳的株高和茎粗有显著影响,在6种不同施肥处理中,以处理4(N50g/株,P2O5100g/株,K2O50g/株)最利于植株的生长。阔叶十大功劳小苗生长需要提供钾肥,3年生植株的生长需要补充氮肥。