四个新城疫病毒强毒株HN基因的同源性分析

新城疫病毒（ＮＤＶ）四平株、昌黎株、青岛株、Ｆ４８Ｅ８株分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚增殖，蚀斑纯化（３代），生物学特性鉴定及结合基因序列分析，表明ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株均为强毒株。经差数、蔗糖密度梯度离心提纯病毒，分别提取ＲＮＡ，利用一对特异性引物及ＲＴ－ＰＣＲ方法，一次性扩增出 ＮＤＶ四平株、昌黎株、青岛株和 Ｆ４８Ｅ８株的全长 ＨＮ基因，分别将该ＨＮ基因克隆入载体ｐＫＳ（－）并进行测序。序列分析表明，这４个毒株ＨＮ基因核苷酸长度均为１７１３ｂｐ，编码５７１个氨基酸，其中四平株和 Ｆ４８Ｅ８株含有５个糖基化位点，青岛株和昌黎株含有 ６个糖基化位点，四平株含有 １２个半胱氨酸残基，而昌黎株、青岛株和Ｆ４８Ｅ８株含有１３个半胱氨酸残基。３个野生毒株与Ｆ４８Ｅ８相比较，核苷酸序列同源性为８５．７％－９９．３％，推导的氨基酸序列同源性为 ８９．５％－９８．８％，其中 ＮＤＶ四平株与标准强毒 Ｆ４８Ｅ８同源关系最近，核苷酸同源性为 ９９．３％，推导的氨基酸同源性为 ９８． ８％。     

口蹄疫病毒结构蛋白P1基因植物表达载体构建及鉴定

通过RT-PCR克隆了口蹄疫病毒(FMDV)全长P1基因,然后与植物的表达盒融合构建了重组质粒pB1131SP1、pBIP1和pBIAP1,并将质粒转化到根癌农杆菌LBA4404和EHA105中,获得了植物双元表达载体。     

用基因枪将P1结构蛋白基因转入玉米及其转基因植株再生研究

在构建口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)结构蛋白P1基因植物表达载体pBIl31SPl的基础上，以玉米自交系8902、340和4112的Ⅱ型胚性愈伤组织为受体，用基因枪轰击法转化玉米，获得抗性再生植株。GUS染色证明外源目的基因在玉米细胞和组织中得到了表达。PCR检测、PCR-Southern杂交、点杂交鉴定证实目的基因P1已整合到再生植株的基因组中，获得了转基因玉米再生植株。     

巴泰病毒诱导小鼠神经母细胞瘤细胞凋亡

为探究巴泰病毒(Batai virus, BATV)在体外能否引起小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)凋亡,本试验利用BATV(NM/12)株感染N2a细胞,主要通过WST-8法检测细胞感染后的活性,IFA确定细胞内的BATV。再利用Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞感染BATV不同时间和剂量后诱导细胞凋亡的情况。而且进一步通过Caspase-3活性检测分析BATV对细胞凋亡通路中主要调控分子的影响。WST-8试验结果显示,BATV感染可引起N2a细胞活性明显下降,IFA检测发现绿色荧光主要存在于细胞胞浆中,证明BATV可在N2a细胞中复制。流式细胞仪检测发现,BATV可诱导N2a细胞发生早期和晚期凋亡,并且凋亡程度随着病毒含量和感染时间的增加而加大。另外,Caspase-3活性检测结果显示,BATV在感染细胞过程中可活化凋亡相关因子Caspase-3,进一步证明BATV可以诱导N2a细胞凋亡。结果表明,BATV可诱导N2a细胞发生凋亡,并且能够促进细胞凋亡蛋白Caspase-3表达水平上升,为深入探究BATV调控神经细胞凋亡的分子机制及抗病毒药物的研制奠定了基础。     

双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对肺癌干细胞的抑瘤作用

为了探索双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a(Ad-VT)对肺癌干细胞的抑制作用,本研究采用无血清悬浮方法培养肺癌干细胞,采用流式细胞术鉴定肺癌干细胞;通过CCK-8法检测肺癌干细胞对化疗药物敏感性及Ad-VT对肺癌干细胞的特异性杀伤能力;通过TMRM、Annexin V染色检测Ad-VT诱导肺癌干细胞凋亡能力;Western blot检测干细胞调控因子、耐药蛋白和迁移侵袭相关蛋白表达水平。结果显示,成功分离和培养了肺癌干细胞,肺癌干细胞对化疗药敏感性低,Ad-VT对肺癌干细胞有显著杀伤作用,可引起肺癌干细胞线粒体膜电位降低,诱导细胞凋亡,并抑制肺癌干细胞的迁移和侵袭。结果表明,双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对肺癌干细胞具有显著抑瘤作用,是现有治疗方案的有效补充。     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。     

2000年动物克隆及相关领域研究进展

1　猪的克隆成功与异种器官移植　　继 1 997年绵羊 Dolly克隆成功后[1 ] ,1 998年克隆了牛和小鼠 [2 ,3 ] ,1 999年克隆了山羊[4] 。我国科研人员在1 999年和 2 0 0 0年也成功克隆了山羊[5 ,6] 。在 2 0 0 0年 3月1 4日 ,PPL公司宣布通过体细胞核移植技术产生了 5头克隆猪 [7] 。 5头小猪与作细胞核供体的母猪一样全是雌性。之后 ,Polejaeva等 [8] 和 Onishi等[9] 2个研究组分别在《Science》和《Nature》上报道了通过体细胞核移植技术克隆猪的研究。克隆猪不像克隆绵羊和牛 ,其困难是植入母猪子宫中至少要有 4个以上胚胎才能保证成功…     

鸡痘病毒282E4株基因组3.6kb Bam HI片段序列测定与分析

本实验将我国FPV282E4 株基因组3 .6kb BamHID片段利用DNA测序仪进行了序列测定。经DNASISV3.0 分析,该片段A T含量为60.77 % ,内含有8 个主要的ORFS。用Goldkey V3.0 软件比较了VVP7.5 早期启动子,FPV4b 晚期启动子、L2R早/晚期启动子和一个早/ 晚期双向启动子与各个ORF上游100bp 区域的同源性,没有发现有意义的同源序列;该片段的核苷酸序列和每个ORF所编码的氨基酸序列在EMBL核酸序列库和蛋白质序列库(Swiss_PROT) 中没有找到有意义的同源序列。初步认为该片段可能是基因组中一段非必需区或非编码区     

鸡痘病毒282E_4株基因组2.9kbBamHI片段的序列测定与分析

对我国鸡痘病毒 ( FPV) 2 82 E4株基因组 2 .9kb Bam HI片段进行了序列测定与分析。结果表明 ,该片段全长 2 92 3 bp,A T含量为 72 .0 8%,含 6个完整的开放读码框架 ( ORF)和 2个不完整的 ORF,最大的ORF所编码多肽的相对分子质量为 2 4 60 0。在 2个 ORF的上游存在痘苗病毒晚期启动子的保守序列TAAAT,在 6个 ORF的下游和 2个 ORF的编码区内存在痘苗病毒早期转录终止信号 T5NT。把该片段的核苷酸序列和每个 ORF所编码的氨基酸序列分别对 EMBL核酸序列库和 SWISS-PROT蛋白质序列库进行了同源性搜索 ,未发现同源性片段     

应用抗多肽抗体鉴别新城疫病毒强弱毒株

在克隆我国流行的新城疫病毒（ＮＤＶ）强毒株Ｆ４８Ｅ８株、四平株及弱毒株长春株、Ｖ４株和ＨＮ和Ｆ基因并进行测序的基础上,针对我国流行的ＮＤＶ强毒株Ｆ蛋白前体（Ｆ０）的Ｆ２片段的特异结构,人工合成特异性多肽,将其与小牛血清白蛋白（ＢＳＡ）化学偶联制备成全抗原,免疫小鼠制备出抗多肽血清。经ＥＬＩＳＡ检测,该抗体与ＮＤＶ强毒株呈强阳性反应,而与鸡痘病毒、鸡传染性法氏囊病病学、ＮＤ 弱毒株长春株和Ｖ４株呈阴