我国牡丹商品化生产存在的问题及几点建议

对我国牡丹栽培历史和现状进行了归纳,提出现在牡丹商品化生产中主要存在的问题包括自有品牌少,缺乏各自特色,并且没有统一的质量标准体系。根据这些特点,文章提出了一些解决问题的建议和看法。     

牡丹促成栽培中糖信号调控成花的机理研究

以牡丹栽培品种‘洛阳红’为试材，在促成栽培条件下对花芽进行剥叶和涂抹赤霉素处理，探究其对花芽发育、叶片气孔特征、葡萄糖、果糖、蔗糖和海藻糖–6–磷酸（T6P）水平以及糖信号相关基因表达模式等的影响。结果表明，剥叶和赤霉素处理均有效促进牡丹花蕾发育且能够显著促进叶片气孔的发育，提高气孔的开度；剥叶和赤霉素处理能够促进蔗糖和葡萄糖的代谢，并通过促进T6P的积累触发糖信号，最终通过上调PsTPS1及抑制PsSnRK1和PsHXK1在叶片中的表达，诱导花蕾发育。     

月季RhRTE1 的克隆及其对乙烯响应特性分析

 利用数据库中已发表的拟南芥AtRTE1基因序列,从构建的月季花朵乙烯响应EST数据库中筛选得到一个RTE1同源片段,结合RACE技术,从月季切花品种‘Samantha’花瓣中克隆得到全长为1 233 bp的RTE1同源基因。该基因包含一个732 bp的开放阅读框、339 bp的5′非翻译区和162 bp的3′非翻译区,编码一个243 aa的肽链,其理论分子量为27.6 kD,等电点为6.87。该基因推定的氨基酸序列与拟南芥AtRTE1同源性较高,属于RTE家族中的第1组别基因,命名为RhRTE1。该基因在月季花朵自然开放中表达逐步增强,并能够被外源乙烯和切伤处理所显著诱导。将35S::GFP-RhRTE1融合蛋白转入拟南芥,发现RhRTE1蛋白主要定位于细胞膜上,并且转化植株降低了对乙烯的敏感性。以上结果说明RhRTE1可能参与了乙烯介导的月季花朵开放过程,并可能参与了花朵响应伤害的修复过程。     

牡丹隐花色素基因PsCRY2的克隆与表达分析

以‘秋发1号'和‘洛阳红'牡丹(Paeonia suffruticosa)为试验材料,采用RT-PCR的方法从花芽中克隆得到1个隐花色素基因Cryptochrome 2,其ORF全长为1902 bp,编码633个氨基酸,基因登录号为KP982893。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含1个PHR和1个CCT结构域,与拟南芥中AtCRY2最为相似,将其命名为PsCRY2。系统进化树分析表明,PsCRY2与甜橙(Citrus sinensis)CsCRY2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,PsCRY2在牡丹的不同组织器官中均有表达。其中,成年植株的花芽以及种子胚的表达量最高,幼苗根、茎、叶次之。在整个花芽分化不同时期,PsCRY2的表达呈现较高的表达水平;在花蕾发育不同时期,PsCRY2的表达呈现先降低再升高而后有降低的趋势,大风铃期表达量最高,推测PsCRY2在花芽分化和花蕾发育的过程中均起到重要作用。在‘洛阳红'和‘秋发1号'牡丹春季花芽发育过程中,PsCRY2的表达均呈升高的趋势,‘秋发1号'显著高于‘洛阳红'。不同光周期条件下,PsCRY2表达稍有不同。与长日照条件相比,短日照条件下PsCRY2在现蕾期和小风铃期的表达量均下降。     

月季切花乙烯受体RhETR3互作蛋白RhTSPO1的筛选和鉴定

利用已构建的月季分裂泛素酵母双杂文库,以月季乙烯受体蛋白RhETR3为诱饵,筛选能够与RhETR3结合的互作蛋白。经酵母回转验证共得到26个阳性克隆。在候选蛋白中发现一个TspO/MBR蛋白家族的成员,命名为RhTSPO1。通过RACE分离了RhTSPO1基因全长,共777 bp,开放阅读框（ORF）为579 bp,编码192个氨基酸。在酵母中,利用酵母生长和β–半乳糖苷酶活性（β-gal）验证了RhETR3和RhTSPO1之间确实存在互作。将RhETR3-GFP和RhTSPO1-mCherry融合蛋白共转入烟草,激光共聚焦显微镜观察发现RhTSPO1和RhETR3蛋白共同定位于内质网上。月季花朵自然开放过程中,RhTSPO1在花瓣中的表达呈现先增强后减弱的趋势,与开放和衰老过程紧密联系,表明RhTSPO1可能参与了花朵开放过程。本试验结果表明乙烯受体蛋白水平的互作调节可能也参与月季花朵开放和衰老的调节。     

牡丹开花调控转录因子基因PsCOL4的克隆、表达与系统进化分析

采用RT-PCR 方法从‘紫罗兰’牡丹（Paeonia suffruticosa‘Ziluolan’）花芽中克隆得到1个重要开花调控转录因子基因CONSTANS-like,其cDNA 全长1 125 bp,编码373 个氨基酸。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含两个B-box 型锌指结构和1 个CCT 结构域,与拟南芥的AtCOL4 最为相似,将其命名为PsCOL4,GenBank 登录号为KF113358。系统进化树分析表明,PsCOL4 与葡萄编码的VvCOL4的亲缘关系最近,属于第1 群组CO 类似基因。实时定量PCR 表明,PsCOL4 在不同组织器官中均有表达,其中茎和叶中的表达量最高,根中最低。在花芽不同发育时期,PsCOL4 的表达呈现递减趋势。不同光周期条件下,PsCOL4 的表达稍有不同,短日照条件下在叶中的表达有所增加,茎中稍有减少。     

激素和非生物胁迫对月季RhPIP1;1 启动子活性的调节作用

 通过反向PCR 方法克隆得到月季（Rosa hybrida L.）‘萨蔓莎’质膜型水孔蛋白基因RhPIP1;1 上游2 126 bp 的启动子序列。PLACE 分析发现，RhPIP1;1 启动子序列中含有GA、ABA 和乙烯等激素诱 导相关顺式作用元件及干旱、低温和盐胁迫等非生物胁迫相关顺式作用元件。在RhPIP1;1promoter：：GUS 转基因拟南芥中发现，RhPIP1;1 启动子活性与植株发育进程相关；几乎所有器官均可检测到GUS 表达， 而且在迅速扩展的器官以及叶片和花的维管组织中尤为强烈。同时在6 d 和9 d 苗龄的转基因植株中，GA 处理上调了莲座叶中RhPIP1;1 启动子的活性，而ABA、甘露醇、NaCl 和冷处理分别下调了莲座叶和根 中RhPIP1;1 启动子的活性。将RhPIP1;1 启动子不同长度的5′端缺失片段融合GUS 基因，并在烟草叶片 中瞬时表达，缺失–580 ~–256 之间的324 bp 片段后，启动子活性显著降低。研究结果表明RhPIP1;1 启 动子对多种激素和非生物胁迫存在响应，并且这种响应具有发育和器官特异性；RhPIP1;1 启动子中–580 ~ –256 区段对于启动子活性具有重要的作用。     

GA和ABA信号转导关键基因在不同温度处理‘凤丹’牡丹种子中的表达分析

采用超高效液相色谱—串联质谱(UPLC–MS/MS)的方法测定了25℃和4℃处理下‘凤丹’牡丹(Peaonia ostti‘Fengdan’)种子播种后8个时期的激素含量变化,并利用qRT-PCR分析GA_3和ABA信号转导4个关键基因的表达模式。结果表明:25℃处理下种子可以正常萌发,而4℃处理下种子在播种后100 d内未萌发。两种温度处理下种子中GA_3含量均呈现先升高后降低的趋势,但25℃处理播种后17 d(下胚轴萌发期)显著高于4℃处理;在25℃处理种子中ABA含量逐渐降低,而4℃处理下短时间降低后迅速升高,且在播种后7~17 d显著高于25℃处理。推测25℃处理下较高含量的GA_3可以促进种子萌发;而4℃处理下较高含量的ABA抑制种子萌发。qRT-PCR分析表明,PoGID1a和PoGAI的整体表达模式与GA_3含量变化趋势类似,呈现先升高后降低的趋势,但播种前期25℃处理下PoGID1a表达量一直显著高于4℃处理,而PoGAI却显著低于4℃处理(21 d除外);PoGAMYB4在25℃处理下呈升高趋势,在4℃处理下先升高后降低,但播种3 d后25℃处理显著高于4℃处理;PobZIP表达趋势与ABA含量变化相似,4℃处理显著高于25℃处理。故推测牡丹种子萌发受GA和ABA调控,GA通过调控信号转导关键基因PoGAMYB4、PoGID1a和PoGAI促进种子萌发,其中PoGAMYB4和PoGID1a可能受GA正调控,而PoGAI受GA负调控;ABA可能通过正调控PobZIP抑制种子萌发。     

紫牡丹远缘杂交后代幼苗的形态标记和ISSR标记鉴定

 以栽培牡丹‘秋发1号’（Paeonia suffruticosa‘Qiufa 1’）为母本,以野生紫牡丹（Paeonia delavayi Franch.）为父本进行远缘杂交,并利用形态标记结合ISSR分子标记对杂交后代2年生幼苗进行早期鉴定。结果显示,形态标记方法可将16株F₁代幼苗分为偏父型3株、偏母型5株和中间型8株;ISSR标记鉴定在L = 0.65时将F₁代幼苗分为偏父型6株、偏母型5株和中间型5株。16株杂交幼苗中有12株表现为ISSR标记与形态标记分组结果一致,另有4株分组结果不一致。认为形态标记结合分子标记的评价方法有利于牡丹杂交后代的早期鉴定。     

牡丹PobZIP1在种子发育中的表达及其与ABA含量的关系

 采用RT-PCR方法从‘凤丹’牡丹（Paeonia ostii‘Fengdan’）种子中克隆得到1个与ABA信号途径相关的转录因子基因PobZIP1,并利用超高效液相色谱—串联质谱（UPLC–MS/MS）的方法测定了不同发育时期种子的ABA含量。PobZIP1 cDNA全长957 bp,编码318个氨基酸,其编码的蛋白C末端含有bZIP转录因子的典型结构域,GenBank登录号为KJ009392。PobZIP1蛋白与拟南芥bZIP转录因子聚类分析显示,PobZIP1转录因子属于拟南芥bZIP转录因子的A亚族,与AtbZIP39/ABI5聚在一起。与其他物种bZIP蛋白的系统进化分析表明,牡丹PobZIP1与蔷薇科的苹果bZIP亲缘关系最近。SqRT-PCR结果表明：PobZIP1在‘凤丹’牡丹根、茎、叶和花芽中均有表达,其中花芽中的表达量最低,根、茎、叶中的表达量相近。在种子发育过程中,PobZIP1的表达呈现出先增加后降低的趋势。ABA含量测定结果显示,随着种子的发育ABA含量迅速上升,达到最大值后缓慢下降并保持在较高水平。推测种子发育后期,较高含量的ABA和表达相对较高的PobZIP1可能是诱导种子休眠形成的原因。