拟南芥抗致病疫霉突变体部分序列分析

目前获得拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体的主要方法是采用激活标签法(activation tagging)(Kakimoto,1996;Kardailsky et al.,1999)。本实验根据拟南芥突变体对致病疫霉表现的抗性差异,利用TAIL-PCR技术对感致病疫霉的拟南芥突变体进行遗传分析,为克隆拟南芥抗致病疫霉基因提供资料。     

不同环境因素对拟轮生镰孢产毒及FUM基因表达的影响

伏马毒素是由拟轮生镰孢代谢产生的一类真菌毒素,广泛存在于玉米及玉米制品中,污染毒素的玉米食品和饲料常引起人类和动物的疾病。分析不同温度(28℃~32℃)和水活度(aw:0.99-0.95)对拟轮生镰孢生物合成伏马毒素B1(FB1)、B2(FB2)以及FUM1、FUM19和FUM21基因表达的影响。结果表明,拟轮生镰孢在温度为30℃、水活度为0.99条件下生长速率最快,伏马毒素的累积量最大;菌株表现出良好的适应性,在较广泛的条件下产生伏马毒素。基因表达结果表明,FUM1和FUM21在温度32℃、0.95水活度条件下相对表达量最高,FUM19在温度30℃、0.95水活度条件下的相对表达量最高。FUM基因相对表达量最大值与拟轮生镰孢最大产毒能力不一致,反应出伏马毒素的生物合成由一系列基因合成控制。     

鸭梨几丁质PbChiIV的克隆与表达

【目的】从鸭梨果实中克隆PbChiIV的全长cDNA序列,检测PbChiIV在根、茎、叶、果实以及在水杨酸（SA）和梨轮纹病菌诱导下的表达特性,以探讨该基因与SA信号转导及抗梨轮纹病菌的相关性。【方法】设计特异引物,克隆PbChiIV的全长序列,将测序得到的核苷酸序列和推导的氨基酸序列在NCBI上用BLAST进行序列相似性分析,利用BiotEdit软件对氨基酸序列进行比对,利用MEGA6.0构建系统发育树,利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在梨不同组织以及在SA和梨轮纹病菌诱导下的表达。【结果】克隆了PbChiIV的cDNA序列为819 bp,GenBank数据库登录号为KJ872676。生物信息学分析表明,PbChiIV编码272个氨基酸,与沙梨的同源性达100%,与毛果杨（XP_006376418.1）、葡萄（NP001268173.1）、拟南芥（CAA74930.1）、紫花苜蓿（ACL36992.1）、蒺藜苜蓿（AAR87869.1）、豇豆（CAA61281.1）、榛子（AEM97876.1）、东方山羊豆（AAP03085.1）、葡萄（NP_001268075.1）、华东葡萄（ABY66958.1）、葡萄（AAB65777.1）、烟草（BAF44533.1）和海岛棉（AER29902.1）的同源性分别为79%、73%、73%、72%、72% 、72%、69%、68%、67%、67%、65%、67%和62%,属于第IV类几丁质酶基因。表达分析表明,PbChiIV在根中的表达量最大,分别是茎和叶的4.32和2.96倍,其次是在果实中的表达量,分别是茎和叶的2.48和1.70倍,在叶片和茎中的表达相对较低。在鸭梨幼果和成熟期果实中,SA和梨轮纹病菌均可诱导该基因表达。SA处理后基因的最大表达量是对照的2.83和3.8倍,病原菌处理后基因的最大表达量是对照的1.82和1.66倍,SA、病原菌处理后基因的最大表达量是对照的2.49和3.43倍,表达量分别在72、24和72 h达到最大值。【结论】PbChiIV可能参与SA介导的植物抗病防卫反应的信号通路,推测其参与梨轮纹病菌引起的防卫反应,在鸭梨抗病过程中起作用。     

玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因组鉴定及途径模型建立

【目的】从全基因组水平鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）的MAPK超家族基因,并对其进行系统进化、基因结构、多重序列比对及保守位点分析,构建玉米大斑病菌中的MAPK级联途径模型,为深入研究该植物病原菌中MAPK级联途径的功能奠定基础。【方法】利用玉米大斑病菌基因组数据库,通过基于隐马尔科夫模型的HMMER 3.0软件搜索基因组,鉴定并获得MAPK超家族成员序列、基因组定位信息;采用MEGA 5.0软件进行系统进化分析;通过GSDS工具进行基因结构分析;利用ClustalX、MEME工具分析MAPK蛋白激酶区的保守性及保守位点。【结果】在玉米大斑病菌基因组中发现了4个MAPK基因、3个MAPKK基因和3个MAPKKK基因。系统进化分析将MAPK分为Kss1/Fus3、Slt2、Hog1及Ime2 4类;MAPKK分为Pbs2、Ste7及Mkk1 3类;MAPKKK分为Ste11、Bck1及Ssk2 3类。基因组定位及基因结构分析表明,MAPK超家族散布在基因组中,且MAPK基因的结构最为复杂多样,MAPKK次之,MAPKKK结构最简单。多重序列比对与保守位点分析表明,玉米大斑病菌MAPK超家族的激酶结构域均高度保守,其中MAPK具有保守的“-TxY-”磷酸化位点,MAPKK含有保守的“-SD[V/I]WS-”磷酸化位点,MAPKKK含有“-G[S/T][V/P][F/M][W/Y]M[A/S]PEV-”特异性保守位点。【结论】全基因组分析表明,玉米大斑病菌中包括4个MAPK基因、3个MAPKK基因和3个MAPKKK基因。通过系统进化、基因结构及多重序列比对和保守位点分析,在玉米大斑病菌中构建了Fus3/Kss1-homolog、Slt2-homolog、Hog1-homolog和Ime2-homolog 4条MAPK级联途径,其中Ime2 homolog为一条新发现的MAPK级联途径。该信息为深入解析植物病原真菌MAPK超家族的功能奠定了基础。     

不同葡萄品种对霜霉病的田间苗期抗性评价

对36个葡萄品种(品系)苗期对霜霉病的田间抗病性进行了评价, 结果表明, 不同葡萄品种(品系) 对葡萄霜霉病的抗性存在明显差异, 绝大多数欧美杂交种的抗性要强于欧亚种葡萄, 供试的10个欧美杂种中, ‘瑞峰无核’对葡萄霜霉病表现为高抗; ‘DEMIR’、‘龙宝’、‘红富士’、‘黑奥林’、‘峰后’5个品种表现为中抗。     

坪草腐霉病菌毒素产生除草活性物质的条件优化

从多年生黑麦草上分离得到了5株腐霉菌(编号依次为PA1、PA2、PA3、PA4、PA5),通过鉴定,PA1和PA5菌株为瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)。将所得5株菌株分别在PD培养基、PS培养基、玉米粉培养基、改良Fries培养基、Czapek-Dox培养基和Richard培养基中进行培养,所得培养滤液、粗毒素对马唐和反枝苋的除草生物活性进行了测定。结果表明,在PD培养基中所产生的毒素除草生物活性最强,在供试的5株菌株中以PA1菌株所产生的毒素除草活性最强。PA1菌株在PD培养基中培养所得粗毒素对马唐、反枝苋、虎尾草、金色狗尾草、野燕麦、稗草、藜7种杂草的生长有明显的抑制作用;对玉米、小麦有轻微药害,而对大豆安全。试验发现,PA1菌株产毒的适宜pH值为7.0,以培养5d的毒素除草活性最强;在100~150r/min条件下,振荡培养所得粗毒素的除草活性要明显高于静止培养。     

拟南芥VTC1的5’UTR内含子功能分析

拟南芥VTC1(At VTC1)是维生素C(Vc)的主要合成途径—L-半乳糖途径的关键酶之一,At VTC1在转录水平和转录后水平均受到调控。通过生物信息学分析发现At VTC1的5’UTR(5’untranslated regions,5’非翻译区)中包含一个内含子,将5’UTR和启动子不同删除片段与报告基因GUS融合,通过检测转基因拟南芥的GUS活性发现这些片段均能启动GUS的高度表达;然而,将5’UTR中的内含子删除后,GUS的表达明显降低,但5’UTR自身并不能启动GUS的表达。序列分析发现,At VTC1的5’UTR内含子包含有多个增强其功能的特征序列,如GATCTG基序。同时,At VTC1在拟南芥和水稻的同源基因中同样具有5’UTR内含子。以上结果表明,At VTC1的5’UTR内含子可能具有增强子的功能,分析保守的5’UTR内含子功能为进一步探究在转录水平上的Vc合成调控机制奠定基础。     

Ste12基因对玉米大斑病菌渗透胁迫的调控作用

前期研究表明,玉米大斑病菌Ste12基因对分生孢子发育和致病性有重要的调控作用。本试验利用Ste12基因的RNAi沉默突变体StRNAi 9-10和StRNAi 3-6分析该基因对玉米大斑病菌渗透胁迫的调控能力。通过比较野生型菌株和RNAi沉默突变体在0.4mol/L CaCl2、1mol/L KCl、1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇等渗透胁迫条件下的菌落形态、生长速度、菌丝形态、产孢量等指标,发现StRNAi9-10对1 mol/L NaCl和1mol/L KCl胁迫的耐受能力显著增强,对1mol/L CaCl2胁迫的耐受能力显著降低,对1mol/L山梨醇的耐受力无显著差异;StRNAi 3-6对4种胁迫条件的耐受能力均显著降低。以上研究结果表明,Ste12基因不仅调控玉米大斑病菌的分生孢子发育和致病力形成,而且参与玉米大斑病菌的渗透胁迫调控。     

油菜素内酯处理后水稻悬浮系细胞的蛋白质组学分析

油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)是植物生长发育所必需的一类植物激素,研究BRs通过影响哪些蛋白的变化影响水稻表型的变化是研究BRs调控水稻生长发育机理的关键.本研究利用近几年发展起来的蛋白质组学和质谱技术鉴定水稻中受BRs调控的蛋白,对BRs处理后的悬浮系进行了双向电泳分析,经质谱分析鉴定到受BR...     

植物病原真菌产漆酶菌株的筛选

 【目的】从常见植物病原真菌中筛选具有漆酶活性的病原菌,对相对酶活力较高的菌株进行漆酶致病力测定,为深入研究漆酶在植物病原真菌致病过程中所发挥的作用及病菌的扩展机理奠定基础。【方法】以2,2’-连氮-双[3-乙基苯并噻唑-6-磺酸](ABTS)为底物,通过平板显色反应筛选得到产漆酶的病原菌,同时利用苯胺蓝(Azure-B)脱色法确定目标菌株降解木质素作用,采用分光光度计法在420 nm下测定漆酶活性,最后利用组织病理学分析漆酶对病原菌致病力的影响。【结果】从20种重要植物病原真菌中筛选得到10种产漆酶的病原菌,且均具有降解木质素的作用,对其中6种颜色变化不同的病原菌进行漆酶活力测定,发现玉米大斑病菌的胞内漆酶活力最高,为18.984 U?mL-1,小孢拟盘多毛孢的胞外漆酶活力最高,为0.919 U?mL-1。致病力测定表明,在玉米大斑病菌的致病过程中,漆酶可以氧化玉米叶片并能够促进病原菌在寄主组织中的扩散。【结论】在产漆酶的植物病原真菌中,漆酶大多以胞内酶形式存在,并具有降解木质素的作用,漆酶可以促进玉米大斑病菌在寄主组织中扩展。